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湖南地区地中海贫血基因检出情况分析

2021-11-01 180 上传者：管理员

摘要：目的了解湖南地区地中海贫血的发病情况及基因分型的特点,为优生优育、提高人口素质提供科学依据。方法采用PCR琼脂糖凝胶电泳法和反向点杂交法检测技术对2018年10月—2020年11月湖南地区送检的抗凝全血标本进行地中海贫血基因分型检测,统计地中海贫血检出情况及基因分型特点。结果送检的5642例患者标本中,检出地中海贫血1477例,检出率为26.18%,其中α地中海贫血、β地中海贫血及α和β双重检出率分别为12.62%（712例）、13.13%（741例）和0.43%（24例）。男性地中海贫血检出率为29.58%,女性为25.41%,不同性别检出率差异有统计学意义（χ2=7.598,P=0.006）。年龄中以<17岁检出率最高,为45.90%,不同年龄间检出率差异有统计学意义（χ2=226.281,P<0.001）。在基因分型方面,α地贫中以SEA缺失型占比最高（65.08%）,β地贫中以IVS-Ⅱ-654（C→T）占比最高（36.86%）。结论湖南地区地中海贫血检出率较高,α地贫和β地贫分别以SEA缺失型和IVS-Ⅱ-654（C→T）为主,具有地域性特征,应加强地中海贫血的检测及做好遗传咨询和产前诊断,以降低地中海贫血儿的出生率。

关键词：
PCR琼脂糖凝胶电泳法
反向点杂交法检测技术
地中海贫血
常染色体单基因
疾病监测
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地中海贫血(地贫)是指珠蛋白基因缺陷(缺失或/和点突变)导致珠蛋白肽链合成减少或不能合成，致使血红蛋白组分发生改变而引起的常染色体单基因。地贫可将致病基因遗传给后代，常见有两种类型，即α地贫和β地贫。中国人群中常见的α-珠蛋白基因的突变类型主要为-αSEA、-α3.7、-α4.2三种缺失型。β地贫常见的突变位点有IVS-Ⅱ-654、CD41-42、CD17-28、CD71-72等。其发病具有明显的民族和地域特点，在我国长江以南地区的发病率较高，好发于广西、广东、福建、海南和云南等省份，是我国南方最常见的血液病遗传病之一[1]。重型地贫可致死，中型地贫可致残，给家庭和社会带来沉重的负担。由此可见，地中海贫血的检测尤为重要，做好遗传咨询和产前诊断，有助于减少地贫儿的出生，提高人口素质。本文对2018年10月—2020年11月湖南地区送检长沙迪安医学检验所进行地中海贫血检测的5642例患者的抗凝全血标本采用PCR琼脂糖凝胶电泳法和反向点杂交法检测技术进行地中海贫血基因分型检测，现报告如下。

1、材料与方法

1.1 材料

标本来源于2018年10月—2020年11月湖南地区送长沙迪安医学检验所进行地中海贫血基因分型检测的5642例患者的抗凝全血标本。

1.2 试剂与仪器

核酸提取试剂盒(亚能生物技术有限公司)、α-地中海贫血基因检测试剂盒(gap-PCR法)(亚能生物技术有限公司，试剂批号A201810003/A201905003/A201912001/A202003005/A202008005)和β-地中海贫血基因检测试剂盒(反向点杂交法)(亚能生物技术有限公司，试剂批号BT201810008/BT201905004/BX201911006/BX202003005/BX202009003),东胜ETC811核酸扩增仪、EPS-300电泳仪(上海天能科技有限公司)、JS-680D凝胶成像分析仪(亚能生物技术有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 标本采集

全血用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml,注入含EDTA(乙二胺四乙酸二钠)或枸橼酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5～10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，密闭送检。

1.3.2 标本提取

往编好号的1.5ml离心管内加入500μl裂解液，加入200μl抗凝全血，剧烈旋涡混匀短暂离心，加入100μl沉淀液，剧烈旋涡混匀，13000rpm离心5min,转移上清液至结合柱凹槽下方，13000rpm离心30s,弃滤液，加500μlW1洗液到收集管，13000rpm离心30s,弃滤液，加500μlW2洗液到收集管，13000rpm离心30s,弃滤液，13000rpm离心2min,取下结合柱套进干净1.5ml离心管，加100μl洗脱液至膜中心，室温放置1min,13000rpm离心1min,弃结合柱，1.5ml离心管内液体即为PCR模板，保存备用。

1.3.3 PCR扩增

分别向PCR反应管中加入提取的待测样品DNA2μl(β地贫)和4μl(α地贫),低速离心数秒后，α地贫按以下参数进行PCR反应：96℃:5min;98℃:45s;65℃:90s;72℃:3min;10个循环；98℃:30s;65℃:45s;72℃:3min;25个循环；72℃:10min;β地贫按以下参数进行PCR反应：50℃:15min;95℃:10min;94℃;60s;55℃;30s,72℃;30s,35个循环；72℃;5min。

1.3.4 扩增产物分析

α地贫：称1.0g琼脂糖+100ml已稀释TBE缓冲液(为全板凝胶)制胶，待琼脂凝固后，轻轻拔掉孔梳，加1μlPCR产物进行DNA点样，电泳检测，在160V电压下电泳约3min后，再在120V电压下电泳约50min,电泳结束后，将琼脂糖凝胶放入凝胶成像分析系统观察结果。把图像结果用电脑软件拍照存档。β地贫：将反应膜条放入15ml离心管，加入A液6ml和所有PCR产物，沸水浴中加热10min后，放入杂交箱43℃杂交1.5～4h,同时将45mlB液于杂交箱预热43℃,杂交后取出膜条，移至装有预热B液的50ml管中，于43℃轻摇洗涤15min,将膜条加入孵育液(A液：POD=2000∶1)30min,用A液室温轻摇洗两次，每次5min,用C液室温洗膜1～2min,将膜条浸泡于现配显色液中避光显色5～10min后，转移至去离子水中浸泡即可观察结果。

1.4 统计学分析

采用SPSS22.0软件进行数据处理，计数资料采用例数(%)表示，不同年龄性别地贫检出情况差异比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 地贫检出情况及基因分型情况

5642例送检患者标本中，检出地贫1477例，检出率为26.18%,其中α地贫、β地贫及α和β双重检出率分别为12.62%(712例)、13.13%(741例)和0.43%(24例),见表1。

2.2 不同性别地贫检出情况

5642例标本中，男性送检标本1038例，检出307例，检出率为29.58%;女性送检标本4604例，检出1170例，检出率为25.41%。不同性别检出率差异有统计学意义(χ2=7.598,P=0.006),见表2。

2.3 不同年龄段地贫检出情况

5642例标本中，送检年龄为0～89岁，将其分为3个年龄段，其中地贫检出数所占百分比最高的是17～60岁，占69.67%(1029/1477),该年龄阶段样本送检数最多，占82.38%(4648/5642)。不同年龄段地贫检出率依次是<17岁、>60岁、17～60岁，差异有统计学意义(χ2=226.281,P<0.001),见表3。

2.4 α和β地贫基因分型情况

α地贫检测三种缺失型(SEA、3.7、4.2),β地贫检测17个点突变(41-42M、654M、-28M、71-72M、17M、βEM、31M、27/28M、IVS1-1M、IVS1-5M、43M、-32M、-29M、-30M、14-15M、CαP、IntM)。1477例地贫标本中，α地贫中以SEA缺失型占比最高(65.08%),β地贫中以IVS-Ⅱ-654(C→T)占比最高(36.86%),见表4。

2.5 地贫基因单一型和复合型分型情况

1477例地贫标本中，单一杂合型有1424例，占地贫标本数96.41%,其中α单一杂合690例，β单一杂合734例；双重杂合或纯合基因型有53例，占3.59%,其中α+β双重杂合24例，α纯合子6例，α双重杂合子14例，α稀有型基因2例，β纯合子3例，β双重杂合子4例，见表5。

3、讨论

α-地中海贫血是一种由于16号染色体16p13.3位点的α-珠蛋白基因突变导致肽链表达失衡而产生的单基因遗传血液病，多由于α-珠蛋白基因的缺失突变所致，在我国人群中常见的α-珠蛋白基因的突变类型主要为-αSEA、-α3.7、-α4.2三种缺失型。β-地中海贫血是一种由于β-珠蛋白基因突变导致肽链表达失衡而产生的单基因遗血液病，多由β-珠蛋白基因点突变所致，在我国人群中常见的突变位点有IVS-Ⅱ-654,CD41-42,CD17,-28,CD71-72等[1]。

从地贫基因检测分型结果来看，地贫基因发病以单一杂合基因型为主，其次为双重杂合子，纯合基因极少见。其中检出α地贫稀有型基因2例(0.14%),一例扩增出-α3.7条带(弱条带)及αα条带及-αSEA条带，血常规指标红细胞压积和红细胞平均体积均降低，采用Gap-PCR方法，特异引物检测X1/χ2融合片段(HKαα或ααααnti4.2的特异片段),结果显示阳性，科研性检测表明该标本可能为HKαα/--SEA稀有基因型；另一例扩增出-α3.7条带(弱条带)及αα条带，血常规指标红细胞压积和红细胞平均体积均降低，采用Gap-PCR方法，特异引物检测X1/χ2融合片段(HKαα或ααααnti4.2的特异片段),结果显示阳性，采用Gap-PCR方法，特异引物检测ααααnti4.2的片段，结果显示阴性，科研性检测表明该标本可能为HKαα/αα或HKαα/αα-3.7稀有基因型。张敏等[2]的研究显示，在福建地区507例-α3.7杂合子中检出25例HKαα/αα(4.93%)、5例HKαα/-α3.7(0.99%)和5例HKαα合并β-地贫(0.99%)。用目前常规的α地贫检测试剂盒无法检出HKαα,当同时又是-α-3.7/αα型时，极易误认为右缺失型或左缺失型后而不再深究造成漏诊[3]。临床工作中应注意少见基因型地贫的出现，结合表型与基因型诊断疑难病例，必要时用基因测序和Gap-PCR等技术检测，据报道，在广东、广西、海南等地区人群中，α地中海贫血发生率为4%～15%,β地中海贫血约为1%～6%[5]。与南方大部分地区相同的是，湖南地区α地贫也是以SEA杂合缺失型为最常见的基因突变类型，β地贫也是以IVS-Ⅱ-654(C→T)、CD41-42(-TTCT)和CD17(α→T)三种突变为主，占89.67%,其他位点共占10.33%[6,7]。常见的三种突变中，IVS-Ⅱ-654(C→T)发生频率高于CD41-42(-TTCT),这种情况与本地区以往报道情况一致，与广东、广西相反，而与湖南另外两个相邻的省江西、湖北较为相似[8,9,10,11]。这些特点表明地贫突变类型有明显的地域特点。

从不同年龄阶段来看，17～60岁的年龄阶段地贫检出数所占百分比最高，占69.67%,从其送检特性来看，多为育龄期妇女进行产前筛查，与广西玉林地区育龄人群检出比例基本一致[12]。<17岁的年龄组送检数较少但其检出高达45.90%,从其送检特性来看，多为幼儿和新生儿。男性送检人数远少于女性，但男性检出率高于女性，可见婚前检查中男性也应该引起重视，加大婚前检查力度。

地中海贫血是危害较为严重的遗传性疾病，目前对地贫人群暂无有效的治疗手段。重症α地中海贫血可导致死产、死胎并影响产妇健康，发生妊娠、产后大出血等病症；重型β地中海贫血临床表现为严重溶血性贫血、肝脾肿大，往往需要靠输血来维持生命，但常因贫血、心力衰竭未到成年即已夭折。因此婚前检查和产前诊断是预防地贫的最有效的手段，对疑似患者进行地贫的基因检测，可大大降低幼儿地贫的发生率，并减轻医疗机构、家庭及社会的负担和压力，对我国的优生优育、提高人口素质具有重要意义。

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文章来源：吴颖,谢艳,李思,张莉,彭荣.湖南地区地中海贫血基因检出情况分析[J].实用预防医学,2021,28(11):1363-1365.