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《天然药物化学实验指导》中黄酮类化合物显色反应的考证

2023-10-17 49 上传者：管理员

摘要：目的探究天然药物化学实验教学中黄酮化合物显色反应多样化及与配套理论教材描述不相符的原因，为《天然药物化学实验指导》中“碱-酸法提取芦丁”实验教学提供参考。方法采用师生合作的方式，以芦丁、槲皮素、芹菜素为对照品，进行精制芦丁供试品的盐酸-镁粉反应、Molish反应和ZrOCl2/枸橼酸反应的鉴定，同时供试品进行聚酰胺薄层色谱分析。结果显色反应表明精制芦丁供试品中含有具3-OH的杂质，薄层色谱表明该杂质为槲皮素。结论《天然药物化学实验指导》中，采用ZrOCl2/枸橼酸反应鉴定精制芦丁供试品时，芦丁中含有少量槲皮素会造成溶液不褪色或不完全褪色。这种现象在实验课中可探究或给予解释。

关键词：
天然药物化学
实验教学
显色反应
芦丁
黄酮类化合物
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天然药物化学是药学、中药学专业的专业必修课，是运用现代科学理论与方法研究天然药物中化学成分的一门学科，主要研究天然药物中各类化学成分的结构特征、物理化学性质、提取分离方法、结构鉴定与生物活性、生物合成规律及途径、体内外动态变化等[1]。笔者所在教研室承担药学四年制本科的天然药物化学授课任务，理论课56学时、实验课54学时。实验课共设置三个实验，均为18学时，其中实验二为“碱-酸法提取芦丁”。

芦丁（rutin）是糖苷类黄酮的一种，由槲皮素（quercetin)3位上的羟基与芸香糖（葡萄糖与鼠李糖1-6连接而成的双糖）脱水而成，超过70种植物或植物来源的粮食中均含有该黄酮，如杏、葡萄、荞麦种子、樱桃、洋葱、李子和橙子等[2]。芦丁除具有维生素P样作用外，还具有多种药理活性，包括抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗细菌与真菌，广泛应用于多种疾病的治疗[3]。

1、事件概述及原因分析

天然药物化学实验课程的选用教材为人民卫生出版社的《天然药物化学实验指导》（第4版），配套的理论教材为《天然药物化学》（第7版）[4,5]。在2022—2023学年秋季学期“碱-酸法提取芦丁”实验教学中，学生通过碱溶酸沉法从槐米（豆科植物槐Sophora japonica的花蕾）中提取芦丁，并依据其在冷水、热水中的溶解度差异进行精制；用ZrOCl2/枸橼酸显色反应鉴定精制芦丁时，学生加入2%ZrOCl2/甲醇溶液后溶液颜色变黄，但继续加入2%枸橼酸/甲醇后溶液未发生褪色现象，与配套理论教材中关于锆盐实验原理的描述（黄酮类化合物分子中有游离的3-OH或5-OH时，3-OH或5-OH、4-酮基与锆盐试剂生成黄色锆络合物，但3-OH、4-酮基络合物的稳定性较5-OH、4-酮基络合物强，故加入枸橼酸后，5-OH黄酮的溶液显著褪色，而3-OH黄酮仍呈鲜黄色[4]）不相符。超出了学生理解范畴，使学生对该实验产生了质疑。

首先核对试剂，未有异常情况发生。其次分析原因，ZrOCl2/枸橼酸反应的溶液未褪色，猜测可能是芦丁的纯度不高，其中含具有3-OH的杂质，杂质的3-OH、4-酮基与Zr4+形成稳定的络合物，使得加入2%枸橼酸/甲醇后溶液不褪色。为考证该猜想是否成立，采用师生合作的方式，使用芦丁（黄酮醇苷，含5-OH）、槲皮素（黄酮醇，含3-OH、5-OH）、芹菜素（黄酮，含5-OH）为对照品（见图1），对实验课获取的精制芦丁进行盐酸-镁粉反应、Molish反应和ZrOCl2/枸橼酸反应的鉴定，过程中设置试剂用量的梯度以优化操作步骤，并使用聚酰胺薄层色谱法鉴定所含杂质。

图1 芦丁（A）、槲皮素（B）、芹菜素（C）的化学结构式

2、精制芦丁的显色反应与薄层色谱

2.1 材料

对照品芦丁（批号：153-18-4）、槲皮素（批号：117-39-5）、芹菜素（批号：520-36-5）（纯度均≥98%，成都钠钶锂生物科技有限公司），其余试剂均为市售分析纯，水为超纯水。供试品为“碱-酸法提取芦丁”实验课中学生提取并精制的芦丁样品。

2.2 供试品及对照品溶液的配制

取供试品16 mg置于25 mL量瓶中，乙醇定容，得供试品待测溶液。

分别取对照品芦丁16 mg、槲皮素8 mg、芹菜素8 mg置于25 mL量瓶中，乙醇定容，得对应的对照品溶液，分别标记为标液1、标液2、标液3。

2.3 供试品的显色反应

盐酸-镁粉反应：取标液1～3及供试品溶液各2 mL分别放入比色管中，设置梯度用量的盐酸与镁粉，即分别加入0.2、0.4、0.2 mL浓盐酸，再依次分别加入0.03、0.03、0.06 g镁粉，观察三组试验的颜色变化情况。

Molish反应：取标液1～3及供试品溶液各2m L分别放入比色管中，设置梯度用量的α-萘酚/乙醇溶液，即分别加入0.3、0.2、0.1 mL 10%α-萘酚/乙醇溶液，摇匀，沿管壁滴加3 mL的浓硫酸，观察三组试验中两液面产生的颜色变化。

ZrOCl2/枸橼酸反应：取标液1～3及供试品溶液各2 mL分别放入比色管中，滴加2%ZrOCl2/甲醇溶液，注意观察颜色变化情况，至溶液变为黄色，继续滴加至颜色不再加深为止，记录消耗的ZrOCl2/甲醇溶液体积；再向试管中加入2%枸橼酸/甲醇溶液，记录颜色变化情况。

2.4 供试品的聚酰胺薄层色谱

取聚酰胺薄层板，以标液1～3为对照，点上供试品样品，用75%乙醇液进行展开。展开一段距离后，吹干，用1%AlCl3溶液对薄层板进行显色，在日光、紫外灯下观察样品斑点的颜色与荧光。

2.5 结果分析

盐酸-镁粉反应结果表明，加入0.4 mL浓盐酸，再加0.03 g镁粉后显色较好且镁粉消化完全，标液1～3及供试品分别呈红色、淡红、黄色、红色。即供试品显色与对照品芦丁相同，符合实验预期，说明实验课中成功从槐米中提取到芦丁（见图2A）。

Molish反应结果表明，加入0.3 mL 10%α-萘酚/乙醇溶液，并滴加3 mL浓硫酸后，标液1、供试品呈现的玫瑰环明显，而标液2、3无玫瑰环现象。符合实验预期，再次说明实验课中芦丁提取成功（见图2B）。

ZrOCl2/枸橼酸反应结果表明，消耗1 mL ZrOCl2/甲醇溶液后，标液1～3及供试品溶液均变黄且颜色不再加深；后加入2%枸橼酸/甲醇溶液，芦丁与芹菜素标液完全褪色，槲皮素标液不褪色，而供试品发生褪色但褪色不完全，最终呈现为浅黄色（见图2C）。这证实了实验前的推论：“碱-酸法提取芦丁”实验课中所用试剂均无异常，供试品不褪色是因为其本身不纯、其中含有具3-OH的杂质。

图2 盐酸-镁粉反应（A）、Molish反应（B）及ZrOCl2/枸橼酸反应（C）显色效果

聚酰胺薄层色谱的结果表明，供试品的主要成分为芦丁，但其中含有少量槲皮素（见图3）。即供试品中具3-OH的杂质为槲皮素。

图3 日光（A）、365 nm紫外光（B）下的薄层色谱图

3、结论与讨论

提取的芦丁中含有槲皮素杂质的相关研究，为本实验的结果提供了有力支撑：孟祥颖等[6]报道通过碱溶酸沉法加热提取芦丁，产物常有9%～13%的水解产物存在；赵文斌等[7]从槐米粉提取芦丁，薄层层析鉴定表明，样品中含有少量槲皮素；舒晓宏等[8,9]从槐花米中提取芦丁时发现，酸碱浓度适宜的石灰水和盐酸可提高芦丁产率，但碱提pH值偏高、酸沉pH值偏低，芦丁粗提率提高的同时带来含量较高的杂质；另有研究者采用有机溶剂提取法，从槐米、苦荞中提取到的芦丁，也均被不同程度地分解为槲皮素[10,11]。笔者查阅资料推断，槲皮素杂质是芦丁在提取过程中被碱水解而产生的：芦丁的苷键为烯醇苷键，对碱不稳定，碱溶液会催化苷键水解[4]；《天然药物化学实验指导》中描述“称取槐花米20 g，取1～1.5 g石灰粉加入10 mL水后研成乳液，槐米在搅拌条件下加入石灰乳，调节pH至8～9，加热至微沸，维持pH保持40min……[5]”；在上述提取过程中，用石灰乳调节溶液pH使呈碱性，加热情况符合芦丁碱水解的条件，故而部分芦丁碱水解生成槲皮素，造成提取的供试品芦丁不纯。

综合上述，“碱-酸法提取芦丁”实验课中，通过碱溶酸沉法提取芦丁时，芦丁发生部分碱水解生成槲皮素杂质，槲皮素含有的3-OH、4-酮基与锆盐试剂形成稳定性强的络合物，故采用ZrOCl2/枸橼酸反应鉴定芦丁供试品时，加入2%枸橼酸/甲醇溶液后，黄色不褪或褪色不完全；而纯净芦丁的5-OH与锆盐试剂形成络合物的稳定性较差，采用ZrOCl2/枸橼酸反应鉴定时，完全褪色。总而言之，实验过程中出现不褪色现象实为芦丁碱水解生成了槲皮素杂质所致，在后续实验授课中可给予解释或进行进一步探讨。

此外，本次实验探究充分体现了基于问题导向（problem-based learning,PBL)[12]的师生合作教学模式，凸显了“以教师为主导、学生为主体”的教学理念。具体来讲，学生在“碱-酸法提取芦丁”实验课中发现了精制芦丁的ZrOCl2/枸橼酸反应的不褪色现象；以两名学生为代表形成学习小组，探讨该问题的可能原因，具有天然药物化学、药物分析学学科背景的教师成立教学组；师生就该问题交流探讨，共同设计用于考证该问题的实验步骤；学生进行实验操作，教师指导实验、答疑解惑；最终师生合作解决了天然药物化学实验教学中的问题。教师在指导学生中获得了成长，学生深刻理解了黄酮化合物显色反应的原理，实验操作得以进一步规范，科研思维也得到引导与培养。基于PBL的师生合作教学模式为深化天然药物化学课程改革[13]提供了思路与方法。

参考文献:

[1]刘畅,徐巍巍,唐雨,等.《天然药物化学实验指导》中"汉防己"的生源考证[J].中南药学,2019,17(7):1167-1168.

[4]裴月湖,娄红祥.天然药物化学[M].7版.北京:人民卫生出版社,2016.

[5]裴月湖.天然药物化学实验指导[M].4版.北京:人民卫生出版社,2016.

[6]孟祥颖,郭良,李玉新,等.芦丁的来源､用途及提取纯化方法[J].长春中医学院学报,2003,19(2):61-64.

[7]赵文斌,许玉华,王鲁石,等.芦丁的纯化及其含量测定[J.时珍国医国药,2007,18(4):876-878.

[8]舒晓宏,冯梅,陈华,等.槐花米中芦丁提取最佳pH值的实验研究[J].大连医科大学学报,2005,27(2):91-92.

[9]张依,周泽纯,全锦秋,等.槐米中芦丁的提取工艺优化及检识[J].中国医药科学,2020,10(3):38-41.

[10]程秀民,尘学兰,高彦慧,等.RP-HPLC测定槐米中芦丁和懈皮素含量[J].中成药,2004,24(8):680-682.

[11]王改玲,周乐,梁冉,等.不同提取条件对苦荞籽粒中芦丁降解的影响[J].西北植物学报,2005,25(5):1035-1038.

[12]程欣,马云淑,陈凌云,等.PBL教学法在生物药剂学与药物动力学实验教学能力提升中的探索性研究[J].中南药学,2017,15(5):700-702.

[13]刘冬,刘艳霞,明乾良,等.天然药物化学课程改革的实践与探讨[J].安徽医药,2022,26(5):1057-1060.