针灸穴位和靶器官之间的关系已成为针刺作用机制研究的热点。研究[1,2]发现电针对胃功能具有调节作用,并初步证实中枢的某些脑区或核团参与了针刺对胃功能的调节[3,4]。海马属于大脑边缘系统的一部分,主要参与学习、记忆等方面的功能调控,与下丘脑、脑干等中枢之间存在着广泛的纤维联系,共同调节内脏功能活动。研究[5]显示迷走神经介导的胃肠道信号可通过多级脑干-内侧隔核通路促进海马依赖的学习记忆功能,而海马学习记忆中枢参与下丘脑中Nesfatin-1对胃传入信息相关神经元兴奋性和胃运动的调控[6]。此外,海马中有大量胃扩张兴奋性和抑制性神经元[7],但这些神经元的类型尚不明确。研究[8]显示中枢γ-氨基丁酸能和谷氨酸能信号可调节禁食状态下胃移行性复合运动Ⅱ期收缩。在针刺“足三里”调节胃肠功能的过程中,海马区被激活[9]。最新研究[10]显示,电针可通过调控海马谷氨酸能信号通路调节胃运动。但是,针刺通过调控海马谷氨酸能神经元活性调节胃功能的研究还鲜见。

近年来,由特定药物激活的受体技术已成为应用最广泛的化学遗传学技术,被广泛用于调控特定神经元的活性。此项技术基于Cre-loxp原理,将突变型人毒蕈碱受体(hM3Dq或hM4Di)以病毒为载体表达于特定神经元内,与氯氮平-N-氧化物(clozapine-N-oxide,CNO)结合后使得特定神经元去极化或超极化,以激活或抑制神经元。本研究借助CaMKII-Cre小鼠,以进食量及胃排空率作为评价胃功能的指标,采用由特定药物激活的受体技术和全细胞膜片钳等技术,探讨海马谷氨酸能神经元在电针促进胃功能中的作用,实现从脑区特定神经元水平揭示电针调节胃功能的中枢机制。

1、材料与方法

1.1实验动物及分组

健康雄性C57BL/6小鼠24只,8周龄,体质量19～25g,由北京维通利华动物科技有限公司提供[清洁级,生产许可证号:SCXK(京)2016-0006];健康雄性CaMKII-Cre小鼠30只,8周龄,由中国科学技术大学生命科学院张智实验室提供。小鼠饲养于中国科学技术大学生命科学院动物行为学研究平台,光照为12h的光/暗循环,室温在22～25℃,适应性饲养1周后进行实验。实验分两部分。第一部分:C57BL/6小鼠随机分为正常组和电针组,每组12只。第二部分:CaMKII-Cre小鼠30只,海马注射化学遗传抑制病毒AAV-DIO-hM4Di-eYFP,注射后21d,选取3只灌注固定取脑,用于荧光显微镜下观察病毒表达;另外3只灌流取脑,用于全细胞膜片钳技术验证病毒功能性;明确病毒正确表达及病毒具有功能性后,将剩余小鼠随机分为4组:对照组、电针组、化学遗传抑制病毒组和化学遗传抑制病毒+电针组,每组6只。所有动物实验按照国家医学动物实验条例执行,实验过程中对动物的处理符合国家科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》中相关规定。

1.2主要试剂及仪器

戊巴比妥钠(山东西亚化学股份有限公司),异氟烷(深圳瑞沃德生命科技有限公司),CNO(美国MedChemExpress),谷氨酸(美国Sigma),化学遗传抑制病毒AAV-DIO-hM4Di-eYFP(武汉枢密脑科学技术有限公司)。SDZ-IV型电子针疗仪(苏州医疗用品厂有限公司),气体麻醉机、脑立体定位仪(深圳瑞沃德生命科技有限公司),10μL微量注射器(上海高鸽工贸有限公司),Axon膜片钳(美国MD),微量注射泵(美国WPI),微透析探针、微透析注射泵(美国CMA),高效液相色谱(HPLC)仪、HPLC柱(荷兰ANTECLeyden),冰冻切片机、荧光显微镜、振动切片机(德国Leica)。

1.3各组干预方法

用于第一部分实验的C57BL/6小鼠分为正常组和电针组。正常组:C57BL/6小鼠正常饲养,不电针;电针组:C57BL/6小鼠正常饲养,电针双侧“足三里”,连续7d。每组的6只用于测定进食量和胃排空率,6只用于在体微透析联合HPLC技术检测海马谷氨酸含量。见图1。

用于第二部分实验的30只CaMKII-Cre小鼠于海马注射化学遗传抑制病毒AAV-DIO-hM4Di-eYFP(这种带DIO的病毒可以特异性地表达在CaMKII-Cre小鼠海马谷氨酸能神经元上,带绿色荧光,标记谷氨酸能神经元;而CNO可以与病毒中的hM4Di结合,抑制谷氨酸能神经元)。病毒表达21d后,选取6只观察病毒表达及验证病毒功能,其中3只灌注固定取脑,用于荧光显微镜下观察病毒表达;另外3只灌流取脑,用于全细胞膜片钳技术验证病毒的功能性;明确病毒正确表达及病毒具有功能后,将剩余小鼠随机分为以下4组,每组6只。对照组:正常饲养,不电针;电针组:电针双侧“足三里”,连续7d(这两组用于脑片膜片钳技术比较海马谷氨酸能神经元的兴奋性);化学遗传抑制病毒组:禁食24h,腹腔注射CNO(1mg/kg,CNO注射后30min起效,4h内有效),50min后,记录30min进食量,90min后取胃,测定胃排空率;化学遗传抑制病毒+电针组:禁食24h,腹腔注射CNO,30min后,电针双侧“足三里”20min,记录30min进食量,90min后取胃,测定胃排空率。见图2。

电针方法:穴位定位参照李忠仁主编的《实验针灸学》(新世纪第2版)中常用实验动物针灸穴位图,“足三里”位于膝关节后外侧,腓骨小头下约3mm处。采用异氟烷吸入式麻醉小鼠,用华佗牌无菌针灸针(25mm×0.25mm)直刺3mm,SDZ-Ⅳ型电针治疗仪的一对电极分别连接刺入双侧“足三里”的两针柄上,频率2Hz/15Hz,强度1～3mA,以小鼠肢体轻微颤动为度。电针20min/次,1次/d,连续电针7d。

病毒注射方法:CaMKII-Cre小鼠以2%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉后,置于脑立体定位仪上,参考小鼠脑立体定位图谱,在小鼠双侧海马(正中线旁开2.2mm,前囟后2.1mm,颅骨平面下2mm)插入自制玻璃电极,在微量注射泵的控制下,以30nL/min的速度将300nLAAV-DIO-hM4Di-eYFP注射到海马。注射完毕留针10min后,缝合头皮,常规饲养21d后,荧光显微镜下观察病毒表达情况,全细胞膜片钳验证病毒功能。

1.4观察指标及检测方法

小鼠进食量及胃排空率测定:各组测定前禁食24h,自由饮水,将预先称量的食物单独给予每只小鼠,小鼠进食30min后,取出食物并再次称量,计算进食量。进食量=进食前食物重量-进食后食物重量。小鼠进食90min后,以2%戊巴比妥钠(80mg/kg)腹腔注射麻醉处死小鼠,开腹暴露胃,迅速结扎贲门和幽门,剪取完整的胃,滤纸吸干称重(全胃重),剪开胃体,去除胃内剩余物后,滤纸吸干再次称重(净胃重),胃排空率=[1-(全胃重-净胃重)/进食量]×100%。

在体微透析联合HPLC测定海马谷氨酸含量:在小鼠自由活动状态下,运用在体微透析技术收集海马中的组织液。用2%戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉小鼠后,借助脑立体定位仪于海马植入微透析套管。准备透析前,把套管中的假探针拔出,插入透析探针(CMA7),将人工脑脊液(3mmol/LKCl,145mmol/LNaCl,1.3mmol/LCaCl2·2H2O)通过注射泵(CMA402)以2μL/min的速度注入海马,透析出海马中的组织液。每管收集20μL样品,收集15管,前5管样品丢弃,后10管样品于-80℃冰箱中保存,用于检测谷氨酸含量。用HPLC技术检测收集样品中的谷氨酸含量。具体步骤如下:首先加入5μL邻苯二甲酸于20μL样品中化学反应3min,然后被自动装载到流动相(19.1968gNaH2PO4,400mL甲醇,加超纯水至2L,pH=3.48)中,混合物以0.35mL/min的速度经过1mm×50mmHPLC柱子进行分离,Alexys在线分析系统(ANTEC)检测。基于标准品数据,运用Clarity软件(ANTEC)分析所测样品中谷氨酸含量。微透析结束后,用2%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉处死小鼠,取脑置于4%多聚甲醛中过夜,依次用20%和30%的蔗糖脱水过夜。冰冻切片机连续冠状切片,厚度40μm,观察微透析套管的位置。

图1第一部分实验流程图

图2第二部分实验流程图

灌注固定取脑:2%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉后,0.9%的氯化钠溶液和4%多聚甲醛先后灌流固定后,取脑置于4%多聚甲醛中过夜,依次用20%和30%的蔗糖脱水过夜。冰冻切片机连续冠状切片,每只小鼠切取含目标脑区海马的脑片10张,厚度40μm,防冻液保存。用于荧光显微镜下观察病毒的表达情况。

全细胞膜片钳脑片制备:以2%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉,待小鼠深度麻醉后,经心脏灌流约20mL冰冷的含饱和氧的改良N-methyl-D-glucamine(NMDG)人工脑脊液,灌流结束,立即取脑,修剪,将含有目标核团的脑块结合琼脂固定在肌槽,肌槽内倒入100mLNMDG脑脊液,通氧,振动切片机冠状切片,切片厚度300μm,切片速度0.14mm/s,用吸管将切好的脑片移到33℃水浴锅内含NMDG脑脊液的烧杯中,通95%氧气与5%的二氧化碳混合气,12min后,将脑片从NMDG脑脊液中移到25℃通氧的HEPES脑脊液中,孵育1h后,进行全细胞膜片钳记录。

脑片全细胞膜片钳记录海马谷氨酸能神经元兴奋性:首先将脑片转移到记录槽内盖网固定,应用蠕动泵向记录槽内连续灌注标准人工脑脊液,建立人工脑脊液循环。然后在10×低倍镜下确定海马位置,再在40×高倍水镜下定位海马内的神经元,因实验要记录发荧光的神经元(谷氨酸能神经元),可以借助汞灯,看到神经元发荧光。玻璃微电极钳制发荧光的神经元,注入不同频率电流诱导海马谷氨酸能神经元动作电位的发放,电流钳模式下记录谷氨酸能神经元动作电位。记录信号经Multiclamp700B放大器获得,参数设置:低通滤波2.8kHz,采样频率10kHz。采集的信号通过Clampfit10.7(AxonInstruments,Inc.USA)软件分析处理。

脑片全细胞膜片钳验证病毒功能性:首先制备海马脑片(方法同上),膜片钳装置下,借助汞灯,找到发荧光神经元(病毒表达部位)。玻璃微电极钳制发荧光神经元,电流钳模式下记录神经元静息电位作为基线,然后将10μmol的CNO溶解在人工脑脊液中,通过蠕动泵灌流脑片,继续记录一段静息电位,如果静息电位下移,发生超极化反应(神经元兴奋性下降),说明病毒具有功能性(抑制神经元活性)。

1.5统计学处理

采用GraphPadPrism6软件进行统计分析和图表制作,所有数据均以均数±标准差(x−±s)表示,两组间比较采用独立样本t检验。以P≤0.05为差异有统计学意义的标准。

2、结果

2.1电针对C57BL/6小鼠进食量及胃排空率的影响

与正常组比较,电针组小鼠进食量和胃排空率显著提高(P<0.01)。见图3。

图3各组C57BL/6小鼠进食量与胃排空率的比较

2.2电针对CaMKII-Cre小鼠海马谷氨酸含量的影响

与对照组比较,电针组CaMKII-Cre小鼠海马谷氨酸含量显著增加(P<0.01)。见图4。

2.3化学遗传抑制病毒的表达和功能验证

在第二部分实验中要标记海马谷氨酸能神经元,记录各组海马谷氨酸能神经元的兴奋性,以及验证海马谷氨酸能神经元活性的抑制,检测进食量和胃排空率的变化,这两个实验都需要海马注射化学遗传抑制病毒。结果表明,化学遗传抑制病毒可以标记海马谷氨酸能神经元,发绿色荧光,病毒在海马谷氨酸能神经元胞体有大量表达;脑片灌流CNO后,静息电位基线下调,静息电位的绝对值增加,细胞发生超极化[11]11],即CNO与表达在谷氨酸能神经元上的hM4Di结合,特异性抑制了海马谷氨酸能神经元,表明该病毒具有功能性。见图5。

图4各组CaMKII-Cre小鼠海马中谷氨酸含量的比较

图5海马注射化学遗传抑制病毒的表达与功能验证结果

2.4电针对海马谷氨酸能神经元活性的影响

通过2.3的实验结果可以看出化学遗传抑制病毒可以标记海马谷氨酸能神经元,发绿色荧光。因此,可以通过全细胞膜片钳技术钳制发绿色荧光的神经元,检测各组海马谷氨酸能神经元兴奋性。结果显示,与对照组比较,电针“足三里”能够增加海马谷氨酸能神经元兴奋性(P<0.01)。见图6。

图6各组CaMKII-Cre小鼠海马谷氨酸能神经元兴奋性的比较

2.5海马谷氨酸能神经元在电针调节胃功能中的作用

通过2.3的实验结果可以看出化学遗传抑制病毒可以在海马谷氨酸神经元表达,且具有功能性。因此,可以通过腹腔注射CNO,抑制海马谷氨酸能神经元,观察电针对其胃功能的影响。结果显示,与化学遗传抑制病毒组比较,化学遗传抑制病毒+电针组CaMKII-Cre小鼠进食量及胃排空率虽有升高趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。见图7。

图7各组CaMKII-Cre小鼠进食量和胃排空率的比较

3、讨论

足三里为足阳明胃经的合穴与下合穴,《灵枢·四时》注“气邪在腑,取之合”;《灵枢·邪气脏腑病形》载“合治内腑”。根据合治内府理论,选取合穴和下合穴治疗六腑病是针灸临床常用的经典方法。一项随机临床试验[12]12]表明,足三里穴位注射新斯的明能够有效促进胃肠蠕动,可治疗胃癌根治性胃切除术后麻痹性肠梗阻。研究[13,14,15]13-15]发现电针“足三里”能够显著改善胃肠道症状,促进正常大鼠、功能性消化不良大鼠、肠易激综合征大鼠等的胃肠运动及胃排空。本实验以进食量和胃排空率作为反映胃功能的指标,结果显示,电针“足三里”能够显著增加小鼠进食量及促进胃排空,表明电针“足三里”对胃功能具有促进作用。

针刺的作用机制是复杂的,但其神经机制是学者们最先关注和研究的。这与神经系统接受来自全身各部的信息,并在各级神经中枢对传入信息进行整合和调控的特点是密切相关的。研究[16,17,18]16-18]发现,脑干、下丘脑及大脑边缘系统等各级中枢都参与针刺的效应机制。有研究[19,20]19-20]表明电针“足三里”可通过增加正常大鼠脑干兴奋性神经递质谷氨酸浓度或谷氨酸受体通路促进胃肠运动。我们前期的研究[21,22]21-22]发现电针胃俞募穴可通过调控脑干迷走神经运动背核(DMV)及海马中谷氨酸含量或谷氨酸受体N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)亚单位活性,调节胃运动。另有研究[23]23]显示电针“足三里”可通过增强DMV中NMDA受体介导的突触传递促进胃运动。以上研究主要聚焦在中枢谷氨酸受体通路,但有关海马谷氨酸能神经元是否参与针刺对胃功能的调控尚未见报道。

谷氨酸能神经元作为中枢神经系统中最为重要的兴奋性神经元,激活时可释放谷氨酸作为神经递质,介导中枢神经系统大约60%～70%的突触传递[24]24]。脑干、下丘脑、海马等都存在丰富的谷氨酸能神经元,参与许多脑内正常功能,包括对内脏功能的调节[25]25]。在本研究中,我们聚焦海马谷氨酸能神经元,以CaMKII-Cre小鼠为研究对象(CaMKII是钙调蛋白依赖蛋白激酶,是谷氨酸能神经元的标志蛋白,CaMKII-Cre小鼠就是在神经元CaMKII启动子中插入了一段Cre酶的基因,Cre-loxp系统可与带DIO的病毒特异性结合,因此注射到海马的带DIO的病毒可以特异地表达在CaMKII-Cre小鼠的谷氨酸能神经元上),结果发现电针“足三里”能够激活海马谷氨酸能神经元,增加海马谷氨酸含量,从而可通过海马谷氨酸能受体通路参与对胃运动的调节。进一步应用化学遗传技术抑制海马谷氨酸能神经元后,发现电针对小鼠进食量及胃排空率的调节作用不明显,表明海马谷氨酸能神经元在电针调节胃功能中发挥重要作用。文献[26,27]26-27]表明海马与大脑皮层高位中枢以及下丘脑室旁核(PVN)、迷走背核复合体等与胃运动有关的中枢间存在极其复杂的纤维联系。DMV作为广泛接收上行高级神经中枢控制并对内脏活动起到支配作用的神经核团,是中枢神经系统对胃肠运动调节的最后通路之一,来自高级神经中枢的谷氨酸能神经纤维是DMV神经元功能活动的重要信号通路[28]28]。有研究[25]25]表明PVN中谷氨酸的输入不仅来源于核团内部,同样也来源于下丘脑内其他核团,包括海马、前额叶皮层等。鉴于此,海马谷氨酸能神经元是否通过与PVN、DMV等形成神经环路参与针刺对胃运动的调节作用尚不清楚,这将是我们下一步的研究方向。

总之,本研究观察到,电针“足三里”可增加小鼠进食量及促进胃排空,该效应可能与激活海马谷氨酸能神经元有关。但是,海马区谷氨酸能神经元通过何种神经环路参与这个过程,尚需进一步探讨。

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