经络，是人体内运行气血、联络脏腑、沟通内外、贯穿上下的通路；腧穴，是人体脏腑经络之气输注于体表的特殊部位，《灵枢·九针十二原》载：“五脏有疾也，应出十二原”。腧穴能够特异性反映和调节脏腑功能，具有诊断和治疗疾病的作用。近年来有学者提出“穴位是‘活’的”的概念，认为腧穴会随着机体状态发生改变，从而呈现“开”与“合”的不同状态[1]。生理状态下，腧穴处于“闭合”状态；病理状态下，穴位被“激活”，除了“按之痛”的躯体感觉外，其功能、穴区活性物质等被“激活”，从而呈现出异常的状态，此时针刺特定的穴位，可对相应的脏腑病理改变起到调节作用，呈现“小刺激大反应”的作用[2]。杨广印等[3]研究发现，消化系统疾病与相关背俞穴部位的按压痛有密切联系，明确证实了脏腑与经穴之间的相关性。研究[4]表明，“激活态”的穴区实质上是一种外周神经源性炎性反应；石宏等[5]研究发现，内脏的伤害性刺激可诱导肥大细胞脱颗粒，进而释放细胞因子与趋化因子，促使相应穴区产生神经源性炎性反应，使穴位处于“激活态”。那么，针刺调节脏腑功能与穴区炎性细胞因子水平的变化是否有一定联系？为此，本研究以急性心肌缺血（acutemyocardialischemia,AMI）损伤为模型，探讨电针干预与“内关”穴区炎性反应的相关性，现报告如下。

1、材料与方法

1.1 实验动物与分组

选取超声心动图正常的8周龄SPF级雄性SD大鼠40只，体质量（250±20)g，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司[动物许可证号：SCXK（沪）2018-0006]，饲养于南京中医药大学SPF级实验动物中心1周，昼夜规律为12h光照/12h黑暗，自由饮食，室温（25±2）℃，湿度（50±5）%。按照随机数字表法将大鼠随机分为假手术组、假手术电针组、模型组、电针组，每组10只。实验过程中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部于2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 主要仪器与试剂

小动物呼吸机（R407，深圳市瑞沃德生命科技有限公司），小动物专用吸入式麻醉机（美国VMRmatrx),PowerLab电生理记录仪（澳大利亚ADInstruments),MyLab多普勒超声仪（意大利ESAOTE），台式高速冰冻离心机（KA1000，上海安亭科学仪器厂），全自动生物组织脱水机（ASP300S，德国Leica），冷热台包埋机（EC350-1，德国Microm），切片机（HM525，德国Microm），病理组织烘漂仪（TEC2500，常州市郝思琳医用仪器有限公司），生物显微镜（CX41，日本Olympus），显微成像系统（DP71，日本Olympus),6.0无菌带线缝合针（F608，上海浦东金环医疗用品股份有限公司），韩氏电针仪（200E，南京济生医疗科技有限公司）。

PBS缓冲液（AR0030，美国Boster),4%多聚甲醛固定液（BL539A，中国Biosharp），异氟烷麻醉剂（1973015，深圳市瑞沃德生命科技有限公司），苏木素伊红混合染色液（R22179，上海源叶生物科技有限公司），TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（KGA7071，江苏凯基生物科技有限公司），大鼠白细胞介素-1β（IL-1β）一抗（JEB-13381，南京金益佰生物科技有限公司），5%BSA封闭液（HY-D0842，美国MCE），大鼠白细胞介素-17(IL-17）一抗（JEB-13564，南京金益佰生物科技有限公司），抗兔二抗（ab150077，英国Abcam）。

1.3 模型制备

模型组和电针组参考文献[6]制备大鼠AMI模型。大鼠以5%异氟烷伴70%氮气+30%氧气快速诱导麻醉，1.5%～2%浓度维持麻醉，仰卧位固定于（37±3）℃手术台上，使用呼吸机进行气管插管和机械通气（呼吸频率为60～70次/min，潮气量为1.0mL/100mg），连接心电监护仪，标准Ⅱ导联监测心电图，手术部位脱毛并消毒，沿着第4、5肋间打开大鼠胸腔，撕开心包膜，迅速挤出心脏，用6.0无菌带线缝合针结扎冠状动脉左前降支（LAD），宽度、深度均为2mm，将心脏还纳胸腔，挤出胸腔气体，防止气胸，关胸逐层缝合，断开呼吸机，清除呼吸道分泌物。心脏表面变苍白或紫绀，同时肢体Ⅱ导联显示ST段弓背抬高，T波高耸，提示AMI模型成功。假手术组及假手术电针组进行同样的插管、开胸等操作，但在LAD下方仅穿线不结扎，后关闭胸腔，实验全程均由同一人操作。

1.4 干预方法

造模成功24h后，假手术电针组与电针组进行电针干预。穴位定位参照《实验针灸学》[7]，取双侧“内关”穴，采用0.30mm×25mm一次性不锈钢针灸针制成双极电针（用医用绝缘胶带将两根一次性针灸针针柄并列缠绕，保持两针身相隔1mm，露出针柄末端和针身）直刺2～3mm，接韩氏电针仪，疏密波，频率2Hz/100Hz，电流强度2mA，电针20min，每天1次，连续3d。

假手术组和模型组接受相同时间及方式的抓取、固定与麻醉，不予电针治疗。

1.5 组织取材

干预结束24h后麻醉各组大鼠，取双侧“内关”穴区皮肤和左心室结扎线以下组织，经PBS缓冲液冲洗后修剪平整，置于4%多聚甲醛中固定24h。梯度脱水后，置于包埋机中包埋，随后在切片机上连续6μm切片，经摊片、烘烤后常温保存以备用。

1.6 指标检测与方法

(1）超声心动图评价大鼠心功能：参考文献[8]，使用Mylab多普勒超声仪采集治疗3d的相关数据。异氟烷快速诱导麻醉后以1.5%～2%浓度维持，胸前脱毛后涂抹超声耦合剂，探头置于胸骨左侧，M型模式下测定左心室舒张末期内径（LVEDD）及左心室收缩末期内径（LVESD），以Teichholz公式计算射血分数（ejectionfraction,EF），以[（LVEDD-LVESD）÷LVEDD]×100%公式计算短轴缩短指数（fractionalshortening,FS）。

(2)TUNEL法评估大鼠心肌细胞凋亡情况：大鼠心肌组织切片脱蜡后，滴加20μg/mL不含DNase的蛋白酶K，室温作用30min后PBS缓冲液冲洗3次；将切片置于3%过氧化氢溶液中室温孵育20min后PBS缓冲液冲洗3次；滴加50μLTUNEL检测液，37℃避光孵育60min后PBS缓冲液冲洗3次；滴加DAPI染剂10min后再次PBS缓冲液冲洗3次，用抗荧光淬灭封片液封片后置于荧光显微镜下观察。使用ImageProPlus软件测算平均吸光度，平均吸光度=累积吸光度值÷测量的染色区域面积，数值越大表示阳性越强。

(3)HE染色法观察大鼠“内关”穴区炎性因子浸润情况：每组随机选择5只大鼠穴区皮肤切片，脱蜡水化后依次按照苏木素染色5min→自来水冲洗→盐酸乙醇分化30s→自来水浸泡15min→伊红溶液染色2min的顺序进行HE染色，随后常规脱水，以中性树胶封固，然后置于普通光学显微镜下观察各组大鼠穴区皮肤炎性因子浸润情况。

(4）免疫荧光染色法检测大鼠穴区局部IL-1β、IL-17的表达：每组随机选择5只大鼠穴区皮肤切片，脱蜡后置于0.1mol/L枸橼酸液修复液中加热至沸腾后关火，待其自然冷却；置于PBS缓冲液中冲洗3次，每次5min，滤纸擦去多余的液体后滴加5%BSA封闭液，室温孵育30min；滤纸擦去封闭液后滴加一抗，置于湿盒中4℃孵育过夜；PBS缓冲液冲洗3次，每次5min，滴加荧光二抗后室温避光孵育60min;PBS缓冲液冲洗3次，每次5min，滴加DAPI染剂室温避光孵育5min;PBS缓冲液冲洗3次，每次5min，用抗荧光淬灭封片液封片后置于荧光显微镜下观察，其中细胞核呈蓝色荧光，阳性表达部位呈红色荧光，使用ImageProPlus软件测算平均吸光度，平均吸光度=累积吸光度值÷测量的染色区域面积，数值越大表示阳性越强。

1.7 统计学处理

采用SPSS26.0软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，方差齐性的多组间比较采用单因素方差分析（onewayANOVA），运用LSD法进行组间两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 各组大鼠心功能比较

与假手术组比较，模型组大鼠心脏EF和FS下降（P<0.001）；与模型组比较，电针组大鼠心脏EF和FS升高（P<0.01），提示大鼠心功能得到改善。见表1。

2.2 各组大鼠心肌细胞凋亡情况比较

与假手术组比较，假手术电针组心肌细胞界限不清且疏散，核呈蓝色荧光，无明显凋亡的心肌细胞，模型组出现大量凋亡的心肌细胞，核固缩，形状不规则且呈绿色荧光，心肌细胞凋亡平均吸光度值增加（P<0.001）；与模型组比较，电针组凋亡的心肌细胞减少，心肌细胞凋亡平均吸光度值降低（P<0.01）。见图1。

2.3 各组大鼠穴区局部病理变化情况

与假手术组比较，假手术电针组和模型组大鼠“内关”穴皮肤真皮层均有炎性细胞浸润；与模型组比较，电针组大鼠穴区皮肤真皮层炎性细胞浸润情况加剧，提示电针可以引发或者加剧穴区局部的炎性反应。见图2。

2.4 各组大鼠穴区局部IL-1β和IL-17表达比较

与假手术组比较，假手术电针组和模型组大鼠穴区局部皮肤中IL-1β和IL-17的阳性表达均增强（P<0.001,P<0.01）；与模型组比较，电针组大鼠穴区局部皮肤中IL-1β和IL-17的阳性表达均增强（P<0.001,P<0.01），提示电针可以引发或者加剧穴区局部IL-1β、IL-17炎性因子的分泌。见图3。

3、讨论

缺血性心脏病是指冠状动脉疾病造成血管狭窄或阻塞从而引起心肌缺血缺氧的心肌损害[9]，以胸骨后疼痛为典型临床特征。《中国心血管病报告2018》[10]显示，由急性心肌缺血（AMI）引起的冠心病病死率和致残率逐年攀升，严重影响人类的生命与健康。针刺治疗冠心病等心血管疾病由来已久，目前大量的基础研究和临床试验[8,11,12,13]均证实针刺能够多靶点、多途径减轻心胸部疾患，缓解其临床症状，降低心血管疾病的发病率，提高患者的生存质量。朱兵教授团队研究[4]显示，心源性牵涉痛可分布于左上肢尺侧面，多为心经、心包经的循行部位，其中内关作为手厥阴心包经之络穴，又为八脉交会穴，具有宽胸理气、通络止痛、宁心安神等功效，因此针刺内关穴被广泛应用于冠心病的临床治疗[14,15,16]，但其具体作用机制尚未完全阐明。通过动物疾病模型模拟病理过程是进行AMI基础研究的必要过程，大鼠冠状动脉左前降支（LAD）结扎法可成功复制左心室前壁心肌梗死，是目前典型的制备AMI模型的方法[17,18]。超声心动图是诊断心脏状况的主要成像方式，可通过2型和M型模式测算相关指标以评价心功能，其中射血分数（EF）和短轴缩短指数（FS）数值的大小与心肌收缩能力有关，是判断心功能的重要指征之一[8,19]。心肌缺血缺氧可诱导心肌细胞凋亡，引起心肌细胞的持续减少和心室的不良重塑，降低心脏功能，是导致心肌功能障碍的主要因素[20,21,22]，故抑制心肌细胞的凋亡，能够减轻冠心病心肌损伤，改善心功能。本研究结合超声心动图和TUNEL染色，结果显示电针干预能够抑制心肌细胞的凋亡，提高AMI大鼠的心功能，与既往研究[8]结果一致。

《灵枢·海论》载：“十二经脉者，内属于脏腑，外络于肢节”，而腧穴是脏腑经络之气输注、渗灌之处，既是脏腑疾病的反应点，又是针刺的作用点[23,24]。现代研究认为腧穴是多组织构成的一个“三维空间”的综合立体结构[25,26]，有学者认为腧穴并不是一个固定的部位，而是疾病过程中体表出现的一种以神经源性炎性反应为主的病理生理学动态改变，20世纪80年代由牛汉璋教授等人提出的“以轴突反射及背根反射”为理论的经络生理学理论得到广泛的关注与认可，该理论认为内脏损伤的刺激信号可通过长轴突反射传向皮肤感觉神经末梢，从而引起皮肤的神经源性炎性反应[27,28]，可以称之脏腑-经穴相关。赵雪等[27]以急性胃损伤家兔为模型，观察到急性胃损伤家兔背俞穴处皮肤出现明显的炎性反应，证实了该理论。穴区的组织细胞化学成分是针灸效应产生的物质载体，脏腑的伤害性信息传递至外周，促使肥大细胞脱颗粒并释放组织胺、5-羟色胺、缓激肽、神经生长因子等化学介质，形成“炎性汤”的分子池[4]，其中细胞因子如IL-1β、IL-17等，是炎性反应的中心介质，在穴区的炎性反应中起重要作用，形成细胞因子网络，共同参与穴区的神经源性炎性反应。IL-1β是IL-1家族的主要成员，可由皮肤成纤维细胞自分泌，具有广泛的生物学活性，其缺失或过度表达均能造成局部微环境的改变[29,30]。作为前炎性细胞因子，IL-1β在炎性反应的最早阶段被释放，刺激中性粒细胞与巨噬细胞并且引发后续的炎性级联反应[31]。研究[32]显示，肥大细胞糜酶在肥大细胞脱颗粒时可以产生活性的IL-1β，参与局部的炎性反应。IL-17是招募中性粒细胞的强大致炎因子，主要由Th17细胞分泌，与其受体结合后能够促进多种炎性介质与趋化因子的表达，介导炎性反应[33]。本研究通过局部穴区HE染色和免疫荧光染色，发现电针和内脏疾病均能引起穴区局部皮肤中炎性因子水平的改变，以模型组为标，可鉴别电针刺激与内脏刺激所引起的穴区炎性反应。结合超声心动图和TUNEL染色的结果，发现电针在减轻AMI心肌损伤、改善心功能的同时，可加剧AMI大鼠“内关”穴局部炎性反应，引起IL-1β、IL-17炎性因子分泌增多，提示心脏功能的变化与“内关”穴炎性因子的改变有一定相关性。

综上所述，电针“内关”穴能够抑制AMI大鼠心肌细胞的凋亡，改善心功能，其心肌保护效应可能与电针调控穴区局部炎性反应相关。结果显示，与假手术组相比，假手术电针组大鼠穴区炎性因子IL-1β、IL-17分泌增多，提示针刺可导致局部穴区出现炎性反应，但这并不会对机体产生不良反应。本研究只选取了两个典型的炎性因子，是否存在其他相关的炎性因子表达发生异常？且针刺是通过什么途径实现对“内关”穴炎性因子和心脏功能的双向调控等，这些问题都值得在后续的研究中深入探索。

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文章来源：孙珂,吴嘉宏,徐森磊,夏雪峰,刘雨晨,白桦,卢圣锋,张宏如,顾一煌.电针“内关”穴对急性心肌缺血大鼠心功能及穴区炎性因子的影响[J].中国针灸,2021,41(11):1249-1255.