肢体缺血-再灌注损伤（limbischemiareperfusioninjury,LIRI）是指肢体缺血一段时间后重新恢复血流灌注，组织器官的损伤程度不但没有减轻反而较缺血时不断加重，肢体功能进一步恶化的综合征，是一种临床上多发生于严重创伤后的复杂病理过程[1]；目前，医学界多认为其与脂质过氧化及氧自由基损伤、钙离子代谢紊乱、细胞凋亡、炎症反应损害等有关，在其分子病理机制研究层面，信号分子靶向调控逐渐成为研究热点[2,3]；不同于Wnt/Ca2+信号通路在心、脑、肝、肾等脏器缺血-再灌注损伤方面的广泛深入研究，Wnt/Ca2+信号通路在LIRI的机制研究则鲜见报道，甚至于骨骼肌型钙调蛋白的研究也未见明显成果出现[4],LIRI骨骼肌损伤的具体分子机制目前也不完全清楚，中、西医均没有疗效稳定的防治方法[5]。本课题组前期通过对不同剂量桃红四物汤预处理大鼠LIRI炎症反应和骨骼肌细胞凋亡的影响的研究发现：中剂量组（0.15g/mL）为最佳剂量，可显著降低TNF-α和IL-1β炎症因子水平，降低炎症反应和细胞凋亡，从而减轻LIRI[6,7]。此外，本课题组体外细胞实验研究发现：经缺氧再给氧诱导损伤的大鼠骨骼肌细胞中，钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ)、蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC）的表达显著上调[8]。作为同属于丝氨酸-苏氨酸激酶家族的CaMKⅡ、PKC，均是将上游病理应激信号与下游调节程序联系起来的重要信号转导介质，是细胞增殖、分化、凋亡、转换等过程中的关键调节因子[9,10],CaMKⅡ、PKC在大鼠体内实验中的表达变化情况值得进一步深入研究，因此，本研究设计动物实验，制备大鼠LIRI骨骼肌损伤模型，以Wnt/Ca2+信号通路中上游信号分子Wnt5a的阻滞剂为阳性对照，通过桃红四物汤干预来观察CaMKⅡ、PKC表达，从Wnt/Ca2+信号通路角度进一步探讨大鼠LIRI骨骼肌损伤机制及桃红四物汤的干预作用，为丰富LIRI的病理机制和防治方法提供实验依据。

1、材料

1.1动物

取80只2月龄SPF级SD雄性大鼠，体质量（230±10)g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK（湘）2016-0002，动物使用许可证号：SYXK（湘）2019-0002。大鼠在湖南中医药大学实验动物中心的无病原体设施中常规饲料饲养，自由饮水，饲养环境为温度20～25℃、相对湿度50%～70%、光照12h。本实验已通过湖南中医药大学实验动物伦理委员会审查通过[伦理审查编号：HN-LL-GZR-201609]，动物福利按照国际相关实验动物法规实施。

1.2主要药物及试剂

桃红四物汤方药:桃仁15g，红花15g，熟地黄10g，赤芍10g，当归10g，川芎10g，由湖南中医药大学第一附属医院制剂科结合现代工艺加工制成药液（规格为250mL/瓶,浓度为0.15g/mL原料药，批号：20160408）。FZR5(20μg/mL，批号：20160206，美国Sigma公司)。

索来宝培养基（DMEM，批号：12100-500，北京索来宝科技有限公司）；GIBCO胎牛血清（FBS，批号：16000-044，北京智杰方远科技有限公司）；0.25%胰蛋白酶-EDTA，（批号：T1350，北京索来宝科技有限公司）；1%青霉素+链霉素（批号：P1400，北京索来宝科技有限公司）；抗CaMKⅡ、抗PKC抗体（批号：BS4773、ab19031，北京博奥森生物技术有限公司）；Trizol[批号：15596-026，爱普拜斯应用生物系统贸易（上海）有限公司]；ReverTraAceqPCRRT试剂盒（批号：FSQ101，东洋纺上海生物科技有限公司）；SYBRPremixExTaqTM(perfectreal-time）试剂盒（批号：DRR420A，大连宝生物工程公司）。

1.3主要仪器

酶标仪（上海培奥分析仪器有限公司）；7500实时PCR扩增仪（美国ABI公司）；GL16M台式高速冷冻离心机（长沙科威实业有限公司）；BD-180S双门冷冻柜（青岛海尔冰箱通用有限公司）；GL16M台式高速冷冻离心机（长沙科威实业有限公司）；BD-180S双门冷冻柜（青岛海尔冰箱通用有限公司）；NISElementsF3.0软件（日本东京尼康）；imageproplusversion6.0（美国MediaCybernetics公司）。

1.4分组与模型制备

将80只SD大鼠按随机数字表分为正常组、模型组、桃红四物汤组、阻滞剂组，每组20只。除正常组外，其他3组均采用课题组前期造模方法[6]用塑料套管和市售橡皮筋阻断SD大鼠右后肢血流4h，制造大鼠LIRI模型，正常组大鼠不阻断血流。

1.5给药方法

桃红四物汤组于造模前3d开始给予桃红四物汤灌胃，2次/d，造模前2h再给药1次，共计7次，具体给药剂量根据所测质量通过体表面积-剂量换算法计算得出，药物剂量浓度的选择依据课题组前期临床实验显示中剂量（0.15g/mL原料药）桃红四物汤为最佳药效浓度[7]，即每只大鼠每日给药剂量为1mL桃红四物汤+3mL蒸馏水；阻滞剂组造模前2h予以腹腔注射1mLFZR5；正常组和模型组动物在处死前不服用药物，同样的时间点给相同体积蒸馏水灌胃。

1.6标本采集与指标检测

1.6.1取材

在缺血再灌注0、2、4、8h4个时间点，各组随机选取5只大鼠，3%戊巴比妥钠（1.5mL/kg）腹腔注射麻醉，麻醉成功后，仰卧位固定在自制大鼠手术台上，右侧后肢相应的区域剪发，复合碘消毒，沿右侧后肢长轴方向依次切开皮肤、皮下组织、深筋膜，充分显露腓肠肌肌腹组织，切取腓肠肌100mg，迅速用冰盐水洗净血液，滤纸吸干水份，剪刀切割剪碎后装入保存管，置于在低温冰箱（-70℃）保存。根据前期实验结果[6,7]，细胞凋亡情况和蛋白的表达选择缺血再灌注损伤后腓肠肌损伤最严重的时间点（8h）进行检测。

1.6.2DAPI荧光染色观察各组细胞凋亡情况

取复灌后8h大鼠部分腓肠肌组织，利用DAPI荧光染色和激光共聚焦显微镜观察骨骼肌细胞凋亡并使用Image-ProPlusversion6.0图像分析系统进行图像分析，每张图片取5个视野，凋亡指数=细胞核浓缩的细胞数/计算细胞总数×100%。

1.6.3免疫组化（IHC）检测腓肠肌CaMKⅡ、PKC蛋白的表达

提取复灌后8h大鼠腓肠肌组织，多聚甲醛固定并切片，3%过氧化氢（H2O2）处理，并与10%山羊血清预孵育，然后与抗CaMKⅡ、抗PKC(1∶100)抗体在4℃孵育后，用HRP标记的IgG孵育样品，用二氨基联苯胺（DAB）进行显色反应，在显微镜下观察显色过程。使用NISElementsF3.0软件在200倍放大的光学显微镜下采集图像。用imageproplusversionv6.0单盲法测量IHC图像的积分光密度（IA）值以反映CaMKⅡ、PKC蛋白相对表达水平。1.6.4RT-qPCR检测腓肠肌CaMKⅡ、PKCmRNA表达采用Trizol法提取腓肠肌总RNA，取约100mg腓肠肌组织加入Trizol溶液，加OligodT181μL,5xM-MLVbuffer4μL，总RNA2μL,M-MLV1μL，补水到20μL体系，按照逆转录酶的说明书进行逆转录以获得cDNA。PCR反应体系：SYBRR○PremixExTaqTM(perfectreal-time）试剂盒的mix10μL,cDNA1μL，上下游引物各1μL（引物序列见表1），补水到20μL体系。PCR反应条件：按照SYBRR○PremixExTaqTM(perfectreal-time）试剂盒说明进行。以GAPDH的相对表达为对照，测定靶基因的相对表达量，并使用2-ΔΔCT计算目标mRNA的相对表达变化。ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因，ΔΔCt=ΔCt对照组-ΔCt样品组。

表1CaMKⅡ、PKCRT-qPCR引物序列

1.7统计学分析

实验数据以“”表示，应用SPSS17.0软件进行统计分析，采用独立样本t检验对建模前后数据进行比较，单因素方差分析(ANOVA)用于多重比较，然后进行Fisher最小显著性差异检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1各组DAPI荧光染色结果比较

荧光显微镜下可见正常组细胞核呈圆形或椭圆形状，核形完整，染色均匀；除正常组外，其余各组均可见凋亡小体，即核碎裂成大小不等的圆形小体，并被细胞膜所包绕，细胞核边缘不规则，细胞凋亡率明显高于正常组（P<0.05)；桃红四物汤组、阻滞剂组细胞着色较重，核出现浓缩、呈新月形聚集于核膜一边，但细胞凋亡率明显低于模型组（P<0.05）。结果见图1、图2。

图1各组大鼠缺血-再灌注8h后腓肠肌细胞核荧光染色图

图2各组大鼠腓肠肌缺血-再灌注8h后细胞凋亡率比较

2.2各组大鼠腓肠肌CaMKⅡ、PKCmRNA表达比较

与同一时间点正常组比较，模型组、桃红四物汤组、阻滞剂组中CaMKⅡ、PKCmRNA表达上调(P<0.05)；与同一时间点模型组比较，桃红四物汤组、阻滞剂组CaMKⅡ、PKCmRNA表达下调(P<0.05)。结果见图3-4。

2.3各组间大鼠腓肠肌CaMKⅡ、PKC蛋白表达比较

与正常组比较，模型组、桃红四物汤组、阻滞剂组中CaMKⅡ、PKC蛋白表达显著上调(P<0.05)；与模型组比较，桃红四物汤组、阻滞剂组CaMKⅡ表达下调(P<0.05)、PKC表达无显著差异(P>0.05)。见图5-7。

3、讨论

对于缺血-再灌注损伤的前沿研究，目前主要集中在心、肝、脑、肾等重要内脏器官方面，研究的热点大多集中在Wnt/Ca2+通路中关键蛋白介导的细胞内钙超载以及炎症因子释放两个方面[11,12]，团队前期研究[13]也发现Wnt/Ca2+信号通路在LIRI钙离子代谢及炎症反应中起着至关重要的作用；CaMKⅡ、PKC是Wnt/Ca2+信号通路里起重要作用的两个关键蛋白，是一组可依赖于Ca2+和肌醇磷脂信号激活的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在体内广泛存在，是细胞增殖、分化、凋亡、转换等过程中的关键调节因子[9,10]，多项研究[14,15,16,17]发现，CaMKⅡ、PKC通过介导细胞内钙超载参与神经、心肌、血管平滑肌等细胞的凋亡，而且证实降低CaMKⅡ、PKC的活性，抑制钙超载发生机制可起到对受损细胞的保护作用，降低细胞凋亡的发生率。

图3各组间大鼠不同时间段腓肠肌CaMKⅡmRNA表达情况

图4各组间大鼠不同时间段（0、2、4、8h）腓肠肌PKCⅡmRNA表达比较

图5各组间大鼠腓肠肌CaMKⅡ蛋白阳性表达

图6各组间大鼠腓肠肌PKC蛋白阳性表达

图7各组大鼠腓肠肌组织CaMKⅡ、PKC蛋白阳性表达的积分光密度值比较

中医对于LIRI病机的认识多集中在瘀血内阻，气血运行不畅等方面，证属“气滞血瘀”，而治疗则以“通行血脉”“化瘀消肿”为法，团队前期研究[18]发现活血化瘀类中药可以改变钙调蛋白表达的强弱从而达到减轻LIRI骨骼肌细胞凋亡；桃红四物汤是中医传统活血化瘀经典方剂之一，近期研究[19,20]表明:桃红四物汤及其组成中药(桃仁、红花、当归、川芍、地黄、赤芍)在临床应用以及动物实验中，均表现出对缺血-再灌注损伤性疾病有明显干预效果。有学者[21,22]从基因传导通路方面证实桃红四物汤对脑缺血-再灌注损伤具有保护作用。本课题组体外细胞实验研究[8]也发现：经缺氧再给氧诱导损伤的大鼠骨骼肌细胞中，Wnt/Ca2+信号通路中钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）、蛋白激酶C(PKC）的表达显著上调，而桃红四物汤预处理后可通过调控Wnt/Ca2+信号通路中Wnt5a/IP3R/CaMKⅡ途径来减轻LIRI。

本研究显示：桃红四物汤组、阻滞剂组细胞凋亡率低于模型组，说明阻滞剂、桃红四物汤预处理可减少细胞凋亡，从而达到减轻LIRI作用。RT-qPCR和IHC结果显示，与正常组相比，各组大鼠CaMKⅡ、PKC蛋白和其mRNA表达一致性上调(P<0.05)，这说明CaMKⅡ、PKC是LIRI中的关键蛋白；与模型组相比，桃红四物汤组、阻滞剂组CaMKⅡ蛋白及其mRNA表达一致性下调(P<0.05)，提示CaMKⅡ是Wnt5a/Ca2+信号途径的关键蛋白，通过桃红四物汤干预可起到类似Wnt5a/Ca2+信号通路阻滞剂效应下调CaMKⅡ的表达从而减轻肢体缺血-再灌注损伤。与模型组比较，桃红四物汤组、阻滞剂组PKCmRNA表达下调(P<0.05)，但缺血再灌注损伤8h后，桃红四物汤组、阻滞剂组PKC蛋白表达和模型组比较差异无统计学意义，PKC蛋白和其mRNA表达变化不一致，这提示PKC不是LIRI过程Wnt5a/Ca2+信号通路中的主要作用靶点。这一方面可能跟PKC调节结构域有关，研究[23]发现PKC包含12种以上的亚型，按照调节结构域的不同将PKC分为3类：依赖于磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)、Ca2+和单酰甘油的传统型PKC(conventionalPKC,cPKC），由α、βⅠ、βⅡ、γ等亚型组成；仅受DAG调控的新型PKC(novalPKC,nPKC），包括δ、ε、θ、η等亚型；无需Ca2+和DAG仅能被PS激活的非典型PKC(atypicalPKC,aPKC），共有ι、λ、ζ、μ等亚型；另一方面，鉴于缺血-再灌注损伤复杂的病理生理机制、G蛋白偶联受体信号转导系统的复杂性以及Wnt/Ca2+通路与炎症信号途径组成了繁杂的网络系统等原因，因此，PKC可能不是LIRI过程中Wnt5a/Ca2+信号途径桃红四物汤的主要靶点，与课题组前期研究的体外实验研究结果一致[8]。此外，本课题组主要探讨研究“基于Wnt/Ca2+信号通路研究LIRI骨骼肌细胞凋亡机制及桃红四物汤的干预作用”，因此，本研究从Wnt/Ca2+信号通路角度来探讨LIRI的分子病理机制，在CaMKⅡ、PKC基因表达水平方面设计了0、2、4、8h4个时间点进行检测，研究显示，各组CaMKⅡ、PKCmRNA在不同再灌注时间（0、2、4、8h）的表达显示相同的倾向性，而本研究在设计检测分析CaMKⅡ、PKC蛋白表达时，主要以复灌后8h为主要研究时间点，同时也与本课题体外细胞实验设计保持一致。

综上所述，CaMKⅡ、PKC为大鼠肢体缺血-再灌注骨骼肌损伤中的关键蛋白，桃红四物汤可通过调控Wnt5a/Ca2+信号通路下调CaMKⅡ表达来减轻肢体缺血-再灌注损伤，PKC不是Wnt5a/Ca2+信号通路中桃红四物汤的主要作用靶点，这为LIRI骨骼肌细胞损伤的分子机制和桃红四物汤的防治作用提供实验证据。

参考文献：

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文章来源：李武平,李婕,易南,刘宗义,黄思琪,朱付平.桃红四物汤对大鼠后肢缺血-再灌注损伤骨骼肌CaMKⅡ､PKC表达的影响[J].湖南中医药大学学报,2021,41(05):678-684.

基金：国家自然科学基金项目(81674008);湖南省自然科学基金项目(2020JJ4070);湖南省教育厅科学研究基金项目(20C1426)