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基于网络药理学研究紫兰方治疗扁平疣的作用机制

2024-09-14 121 上传者：管理员

摘要：目的基于网络药理学的方法探讨紫兰方治疗扁平疣的作用机制。方法通过TCMSP检索紫兰方中所含中药的主要化学成分，并收集其相对应靶点；通过GeneCards数据库获得与扁平疣相关的疾病靶点；构建PPI网络。利用Bio-conductor数据库进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。结果根据筛选条件获得药物靶点238个，获得疾病靶点437个，核心靶标62个；PPI蛋白作用网络分析，核心蛋白涉及细胞肿瘤抗原p53(TP53)、Rac-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1);GO功能富集分析发现主要参与了T细胞活化、上皮细胞增殖；KEGG通路主要涉及人乳头状瘤病毒感染、NF-κB信号通路等。结论紫兰方治疗扁平疣是多成分、多靶点、多途径的，为进一步研究其作用机制提供依据。

关键词：
扁平疣
扁瘊
病毒性皮肤疾病
紫兰方
网络药理学
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扁平疣是临床多发的有损于外观美感的病毒性皮肤疾病，由感染人乳头状瘤病毒引起，主要表现为肌肤暴露部位骤然出现扁平丘疹，边界清，质硬，形态、大小不等，浅褐色或正常皮色，常合并同形反应，部分患者会有瘙痒感觉[1]。西医治疗该病以抗病毒剂、免疫调节剂等全身治疗或局部治疗为主，中医治疗以调气活血，解毒软坚为主。紫兰方是由皮肤科泰斗赵炳南先生首创，并记载于《简明中医皮肤病学》[2],该方由马齿苋、板蓝根、大青叶、紫草根、薏苡仁、赤芍、红花等组成。方中重用马齿苋、板蓝根解毒祛疣，清热凉血为君；独以大青叶为臣，加强君药消疣功效；佐以紫草、薏苡仁清热解毒凉血，祛风透疹消癥；使以红花、赤芍活血祛瘀，通经透疹。诸药共奏调气活血，解毒软坚之功。紫兰方被广泛应用于扁平疣的临床治疗且效果显著。故文章从成分-靶点-通路出发，通过网络药理学的研究方法分析紫兰方治疗扁平疣的作用机制。

1、材料与方法

1.1 紫兰方药物活性成分及靶点收集

使用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP),分别以马齿苋、板蓝根、大青叶、薏苡仁、紫草、赤芍、红花为关键词检索每味中药的化学成分，在此基础上，收集整理以口服生物利用度(OB)≥30%、类药性指数(DL)≥0.18为条件，筛查化学成分及其对应靶点，并将靶点与Uniprot数据库进行匹配和规范。

1.2 扁平疣靶点收集

基于GeneCards数据库以“flat warts”为关键词检索疾病靶点，以Relevance score≥1为条件筛选，同样采用UniProt数据库进行匹配和规范。

1.3 复方-疾病交集基因的获取

使用R软件中的Draw Venn Diagrams工具，对已收集到的经Uniprot数据库匹配和规范后的药物靶点和疾病靶点进行处理，从而消除重复和伪阳性的基因，获得紫兰方与扁平疣的交集基因靶点。

1.4 中药复方调控网络构建

利用Cytoscape 3.7.1软件中的Network Analyze插件构建紫兰方治疗扁平疣的调控网络，将筛选出的药物、成分、靶点绘制“药物-成分-靶点”网络图，进行相关的可视化分析。

1.5 蛋白互作网络构建

使用STRING数据库，通过已取得的交集基因靶点，将物种选择为“Homo sapiens”,置信度设置为0.900,构建紫兰方治疗扁平疣核心靶标的PPI网络。

1.6 GO功能富集和KEGG通路富集分析

基于Bioconductor中的R包对核心靶点的生物学过程，以及发生作用的信号通路进行富集分析。物种选择为人，设置阈值P<0.05,其余默认原始设置，以长条形图或气泡图形显示部分结果。

2、结果

2.1 紫兰方药物活性成分及靶点

通过TCMSP检索得到紫兰方的有效活性成分共117种，筛选删除重复靶点后，共获取相关靶点238个。

2.2 筛选紫兰方-扁平疣的共同靶点

通过GeneCards数据库检索，共收集437个扁平疣相关靶点。利用R语言将紫兰方的有效成分靶点和扁平疣的相关基因靶点进行匹配比较后，得到62个潜在靶点基因，62个核心靶点。

2.3 构建中药复方调控网络

将上述获取文件资料输入Cytoscape 3.7.1中构建紫兰方治疗扁平疣的调控网络，每条边代表活性成分与靶点的关系。见图1。

图1 药物-成分-靶点网络图

2.4 PPI网络构建与分析

打开STRING数据库对上述材料取得的交集基因初步构建蛋白作用网络。网络连接程度代表蛋白之间的关系，连接程度与蛋白之间关系呈正相关联系，两者呈正比。经分析可知细胞肿瘤抗原p53(TP53)、Rac-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1)、雌激素受体(ESR1)等的连接程度最高。见图2。

图2 紫兰方治疗扁平疣潜在PPI网络

图3 GO功能富集分析气泡图

2.5 交集基因的GO和KEGG通路富集分析

运用Bioconductor中的R包对核心靶标开展GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。见图3、图4。GO富集中交集基因主要参与T细胞活化、上皮细胞增殖、凋亡信号通路的调控等方面发挥作用。KEGG富集中交集基因主要参与调控人乳头状瘤病毒感染、NF-κB信号通路、IL-17信号通路、肿瘤坏死因子等相关通路。

图4 KEGG 通路分析气泡图

3、讨论

扁平疣属中医“扁瘊”范畴。黄莺教授对该病的病因病机的认识有以下几点：扁平疣具有一定传染性，主要致病因素是感染“邪毒”;该病病程缠绵，虚人易感，治疗中要考虑到痰、湿、瘀、虚的病机特点；同时此病多发于面部，有损于容貌，易影响患者社交生活，则易致人“郁”[3]。李萍教授在研究中指出紫兰方专为疣目所设，在治疗扁平疣、寻常疣及其他疣症等方面疗效显著[4]。方中重用马齿苋、板蓝根为君，以解毒消疣，清热凉血。马齿苋，性寒，兼具清热解毒，凉血止血作用。《中医药志》言其“清火解毒，凉血止血，治热病发斑，丹毒，咽喉肿痛等症”。而现代药理学研究结果也证明，其多种成分均可诱导人体淋巴细胞转化，增强自然杀伤细胞活性，从而增强细胞免疫功能，起到抗病毒效果[5]。以大青叶为臣，加强君药解毒消疣功效。现代研究发现其煎剂有广谱抑菌和抗病毒作用[6]。佐以紫草、薏苡仁清热解毒凉血，祛风透疹消癥；使以红花、赤芍活血化瘀，通经透疹，使毒邪得散，郁结得解。

本研究发现，槲皮素、木犀草素、山柰酚、β-胡萝卜素、黄芩素等为紫兰方最关键的化学成分。槲皮素为黄酮类物质的一种，普遍存在于各类植物中，有抗炎、抗病毒、增强自身免疫力等多方面的药理活性，它发挥抗炎效果关键是通过控制NF-κB信号通道，从而减少促炎症因子释放，提高抑炎因子的表达[7]。木犀草素和黄芩素能够通过控制病毒增殖，降低免疫损伤，起到抗病毒效果[8-10]。β-胡萝卜素通过促使免疫细胞的生长，提升细胞因子的释放水平，以及提高巨噬细胞的吞噬功能来激发免疫调节功能，提高机体免疫力[11]。槲皮素、木犀草素、山柰酚等主要成分还可以作用于网络中的多个基因靶点，而PTGS2、AKT1、TP53等核心作用靶点也与许多成分有交互作用，这表明紫兰方的活性成分间存在相互协调作用，多靶点调控来治疗扁平疣。同时为了深入阐明靶点之间的功能关联，对中药复方-疾病交集基因靶点进行蛋白相互作用分析表明，TP53、AKT1、ESR1等在网络中的连接程度较高。TP53为细胞周期的相关基因，在调节细胞生长与凋亡等方面起到关键性作用。Akt1是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，参与调节炎症反应[12]。ESR1参与调控真核细胞基因表达，影响靶细胞的增殖和分化。

进一步研究其功能，对交集基因进行GO功能富集分析，结果显示其主要参与了T细胞活化、上皮细胞增殖、凋亡信号通路的调控，曾义斌等[13]在研究中发现，人乳头状瘤病毒侵袭人体，可通过改变T细胞亚群影响人体免疫，导致疾病迁延难愈。扁平疣的发生是人乳头状瘤病毒通过皮肤微小糜烂面进入宿主体内，进而在感染部位的上皮细胞核内复制并转录，但不进入血液循环，不产生病毒血症，在感染初期，病毒侵犯基底层细胞后不会进入高复制阶段[14,15]。紫兰方对上皮细胞增殖具有一定影响，研究发现，人乳头状瘤病毒整个周期都是在上皮内发生，故影响上皮细胞增值可阻断人乳头状瘤病毒发展[16]。Gosmann等[17]在研究中发现，IL-17通过免疫抑制作用在人乳头状瘤病毒相关上皮增生中发挥作用。细胞凋亡信号通路始终贯穿于扁平疣以及其他人乳头状瘤病毒感染疾病的过程中。

KEGG通路富集分析表明靶点通路主要涉及人乳头状瘤病毒感染、NF-κB信号通路、IL-17信号通路、肿瘤坏死因子通路等，其中，扁平疣由人类乳头状瘤病毒感染所致，NF-kB信号通路、IL-17信号通路、肿瘤坏死因子通路都与人乳头状瘤病毒与促炎性细胞因子的相互作用这一过程相关，所以干预炎症反应、抗病毒、调控细胞的增殖与凋亡可能是紫兰方治疗扁平疣的主要途径。细胞核因子NF-kB是多种信号转导通路的汇聚点，在机体防御、组织损伤和应激方面有重要作用，且可以参与调控细胞增殖、凋亡等过程[18]。李小燕[19]通过研究发现，若抑制NF-kB的转录活性，可以降低机体清除人乳头状瘤病毒能力。由此可见，活化NF-kB信号通路可以发挥机体抗击人乳头状瘤病毒的作用，IL-17是由Th17细胞分泌的一种强大的促炎症性细胞因子，参与机体多种炎症性疾病的发生和发展[20]。白志兴[21]试验发现，人乳头状瘤病毒阳性患者的血清IL-17因子水平相比较于阴性患者差异有统计学意义。除此之外，国内外学者均指出，扁平疣患者中TNF-α升高和发病、持续感染等之间存在一定的相关性[22,23]。

综上，紫兰方主要是利用槲皮素、木犀草素、山柰酚、β-胡萝卜素、黄芩素等几种潜在的化学物质，作用于TP53、AKT1、ESR1等基因，进而调控各种生物学功能和多种信息通路来实现治疗扁平疣等目的，为其临床运用提供了理论支撑，但相关结果仍需进一步实验验证及临床大样本研究。

参考文献:

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