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理冲生髓饮有效组分调控相关信号通路对卵巢癌自噬的影响研究

2024-05-13 53 上传者：管理员

摘要：目的观察理冲生髓饮有效组分(LCSSY)调控腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶-失调51样激酶1(ULK1)信号通路对卵巢癌自噬的影响。方法体外培养卵巢癌SKOV3细胞，制备LCSSY含药血清，采用随机数字表法将SD大鼠分为空白对照组和LCSSY低、中、高剂量组。细胞计数盒8法检测卵巢癌SKOV3细胞增殖抑制率；蛋白质印迹法检测计算自噬相关蛋白重组人自噬效应蛋白(Beclin-1)、人微管相关蛋白轻链3Ⅱ与小鼠微管相关蛋白轻链3Ⅰ比值(LC3Ⅱ/Ⅰ)、自噬接头蛋白(P62)以及AMPK/mTOR/ULK1信号通路相关蛋白的表达，并采用AMPK激活剂验证其作用机制。结果给药24、48 h, LCSSY低、中、高剂量组对SKOV3细胞增殖的抑制率均大于空白对照组，且随着药物浓度的增加抑制程度逐渐加强(均P<0.05);另外，给药48 h LCSSY低剂量组、LCSSY中剂量组抑制率均大于本组给药24 h时(均P<0.05)。与空白对照组比较，LCSSY低、中、高剂量组均能够下调Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ的表达，上调P62的表达，且呈剂量依赖性[(0.98±0.02)、(0.59±0.02)、(0.55±0.02)比(1.46±0.12),(4.45±0.21)、(4.00±0.25)、(2.95±0.21)比(5.98±0.23),(0.67±0.02)、(0.94±0.05)、(1.53±0.13)比(0.30±0.02)](均P<0.05)。与空白对照组比较，LCSSY低、中、高剂量组均可以降低AMPK和ULK1表达，升高mTOR复合物1表达，且呈剂量依赖性(均P<0.05)。AMPK激活剂逆转AMPK/mTOR/ULK1信号通路后，与单独LCSSY高剂量组相比，LCSSY高剂量联合AMPK激活剂组使AMPK、ULK1蛋白表达量升高，而mTOR复合物1蛋白表达量降低(均P<0.05)。结论 LCSSY可能通过调控AMPK/mTOR/ULK1信号通路抑制卵巢癌细胞自噬。

关键词：
信号通路
卵巢癌
女性生殖系统
理冲生髓饮
细胞自噬
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卵巢癌是一种起源于卵巢或输卵管和/或累及卵巢或输卵管的异质性肿瘤。在女性癌症病例中，卵巢癌死亡率位居第5位；在女性生殖系统癌症中，卵巢癌死亡率位居第1位[1,2]。中医学认为，卵巢癌属于“癥瘕”范畴，主要发病机制不外乎虚、毒、痰、瘀，《灵枢·口问》:“故邪之所在，皆为不足”,虚是导致发病的内在因素，痰浊凝滞，阻滞气血，瘀血停聚，癌毒侵袭，痰浊、血瘀、癌毒之间相互作用发为卵巢癌[3]。王秀霞教授为全国名老中医，全国第三、第四批老中医药专家学术经验继承工作指导教师。她结合临床诊疗经验提出：“肾阳虚衰、血瘀于胞”是导致卵巢癌发生的主要病因病机。在治疗上，确立“温煦肾阳，搜剔胞络瘀滞”的治法，创立了中药复方理冲生髓饮治疗卵巢癌[4]。本课题组前期研究发现，理冲生髓饮有效组分(LCSSY)治疗卵巢癌可通过抑制癌细胞增殖、诱导凋亡等机制发挥作用[4]。结合网络药理学及分子对接技术发现，LCSSY可能通过调控腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶-失调51样激酶1(ULK1)信号通路影响卵巢癌细胞自噬过程。本研究通过体外实验对其调控自噬的机制进行验证，为卵巢癌治疗提供新的靶点及思路。

1、材料与方法

1.1实验动物及细胞

无特定病原体级雌性SD大鼠40只，体重180～220 g ,均购于黑龙江中医药大学药物安全性评价中心，动物合格证号为SCXK(黑)2013-004。所有大鼠均饲养于黑龙江中医药大学妇科药理实验室净化空气层流架中，恒温(25±2)℃,恒湿45%～50%,保持生长环境清洁。SKOV3细胞株购自江阴齐氏生物科技有限公司。本研究经黑龙江中医药大学附属第一医院伦理委员会批准(HZYLLKY202200901)。

1.2药物及含药血清制备

理冲生髓饮由人参30 g,黄芪50 g,淫羊藿50 g,莪术10 g等8味药物组成，药物均由黑龙江中医药大学附属第一医院药剂室提供。40只大鼠适应性喂养1周，采用随机数字表法分为空白对照组、LCSSY低剂量组、LCSSY中剂量组和LCSSY高剂量组，每组10只。LCSSY低剂量组予2.66 g/(kg·d)[相当于中药饮片8.55 g/(kg·d)]灌胃，LCSSY中剂量组予5.32 g/(kg·d)灌胃，LCSSY高剂量组予10.64 g/(kg·d)灌胃；空白对照组予给药组同容积0.9%氯化钠注射液灌胃，2次/d,持续灌胃7 d[5]。末次灌胃结束后，大鼠禁食但不禁水12 h,腹主动脉取血，采血后室温下静置30 min,离心机3 500 r/min(离心半径13 cm,温度4℃)离心10 min,抽取血清经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，用1.5 ml的EP管分装，57℃恒温水浴锅将过滤后的血清灭活30 min,经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，用1.5 ml EP管分装，置-80℃冰箱保存备用。

1.3主要仪器与试剂

超净工作台(德国Hettich公司)、体式显微镜(日本Olympas公司)、二氧化碳恒温培养箱(美国Baker公司)、酶标分析仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司)、离心机(德国BeckMAN公司)、流式细胞仪(德国Eppendorf公司);1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、抗菌药物(青链霉素)(美国Gibco公司)、细胞计数盒8细胞增殖-毒性检测试剂盒(中国Biosharp公司),人微管相关蛋白轻链3Ⅱ与小鼠微管相关蛋白轻链3Ⅰ比值(LC3Ⅱ/Ⅰ)、SQSTM1/自噬接头蛋白(P62)、重组人自噬效应蛋白(Beclin-1)、AMPK、mTOR复合物1(mTORC1)、ULK1兔多克隆抗体(美国Affinity Biosciences公司)等。

1.4相关操作方法

1.4.1细胞培养

取卵巢癌SKOV3细胞，调整细胞浓度为3×106个/孔接种，应用完全培养基进行培养，将细胞接种于培养瓶中，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养、换液及传代。

1.4.2细胞计数盒8法检测卵巢癌SKOV3细胞增殖抑制情况

将卵巢癌SKOV3细胞培养至70%～80%时，接种于96孔培养板中。根据干预措施的不同，设置空白对照组、LCSSY高剂量组、LCSSY中剂量组、LCSSY低剂量组，每组设置8个孔。给药24、48 h后，用酶标仪于450 nm处检测吸光度，计算各药物组对SKOV3细胞增殖的抑制率，抑制率(%)= (空白对照组吸光度值-加药组吸光度值)/空白对照组吸光度值×100%。

1.4.3蛋白质印迹法检测蛋白的表达

提取总蛋白，采用含10.0%脱脂奶粉的TBS-T缓冲液封闭聚偏氟乙烯膜，加一抗工作液并于4℃孵育过夜。次日，加二抗工作液并于室温孵育1 h。使用电化学发光超敏化学发光底物在凝胶成像系统上对目的条带进行显影。计算Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62及AMPK、mTORC1和ULK1通路相关蛋白的相对表达量。

1.5统计学分析

采用SPSS 23.0统计软件处理数据。计量资料以

表示、GraphPad Prism9软件作图，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 LCSSY抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖

给药24、48 h, LCSSY低剂量组、LCSSY中剂量组、LCSSY高剂量组对SKOV3细胞增殖的抑制率均大于空白对照组，且随着药物浓度的增加抑制程度逐渐加强，两两组间比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。另外，给药48 h LCSSY低剂量组、LCSSY中剂量组抑制率均大于本组给药24 h时，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

2.2 LCSSY抑制卵巢癌SKOV3细胞自噬

与空白对照组比较，LCSSY低剂量组、LCSSY中剂量组、LCSSY高剂量组均能够下调Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ的表达，上调P62的表达，且呈剂量依赖性，两两组间比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表2、图1。

表1 LCSSY对卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制率在空白对照组及不同药物剂量组间的比较

2.3 LCSSY抑制AMPK/mTOR/ULK1信号通路

与空白对照组比较，LCSSY低剂量组、LCSSY中剂量组、LCSSY高剂量组均可以降低AMPK和ULK1表达，升高mTORC1表达，且呈剂量依赖性，两两组间比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表2、图2。

2.4 LCSSY通过抑制AMPK/mTOR/ULK1信号通路调控自噬的验证

AMPK激活剂逆转AMPK/mTOR/ULK1信号通路后，与单独LCSSY高剂量组相比，LCSSY高剂量联合AMPK激活剂组使AMPK、ULK1蛋白表达量升高，而mTORC1蛋白表达量降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表3。

3、讨论

卵巢位于盆腔深部，早期病变不易被发现，大多数患者确诊即为晚期[6,7]。目前该病的临床治疗手段主要有肿瘤细胞减灭术联合化疗、靶向治疗、免疫治疗等，但高复发率及死亡率仍然是临床研究的热点问题。肾为先天之本，肾阳为一身阳气之根本，肾与胞宫又同属下焦，胞宫依赖肾阳的温照，肾阳虚，则命门火衰，阴寒内盛，而致冲任失于温煦，不能温暖胞宫，则胞宫虚寒，而致寒凝血滞，聚成癥瘕，导致卵巢癌的发生。近年来，中医药在肿瘤治疗领域的优势被逐渐挖掘，如具有减轻卵巢癌患者术后化疗的毒副反应、缓解化疗后不适症状、提高患者机体的免疫力、改善骨髓抑制等优势。由此，探索中医药治疗卵巢癌的有效性及作用机制对妇科肿瘤的发展具有重要价值[8]。

表2 LCSSY对卵巢癌SKOV3细胞自噬及通路相关蛋白表达的影响

图1 LCSSY对卵巢癌SKOV3细胞Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白表达影响的电泳图

图2 LCSSY对卵巢癌SKOV3细胞AMPK/mTOR/ULK1信号通路蛋白表达影响的电泳图

表3 AMPK激活剂逆转AMPK/mTOR/ULK1信号通路后对AMPK、mTORC1、ULK1蛋白表达的影响

LCSSY是名老中医王秀霞教授根据张锡纯《医学衷中参西录》的“理冲丸”加减化裁而来，由人参、鹿茸、黄芪、淫羊藿、水蛭、莪术、三棱、浙贝母组成。以人参、黄芪、淫羊藿、鹿茸扶正，其中人参、黄芪可扶助正气兼以固本；淫羊藿补肾壮阳；鹿茸为血肉有情之品，既可补肾助阳，填精益髓调理冲任，又能通过补肾健脾，以达“养正积自除”的目的。以三棱、莪术、水蛭祛邪，其中三棱、莪术均具破血行气，消积止痛之功；水蛭破血逐瘀，性缓而祛瘀不伤正。浙贝母清热散结，可散结以消癥。诸药配伍，以达填肾精、补脾气、消癥积之效。前期研究基础表明，中药复方理冲生髓饮可能通过抑制细胞增殖、侵袭及转移和诱导凋亡等机制发挥抗卵巢癌作用[4]。通过前期研究对理冲生髓饮与卵巢癌进行网络药理学分析及分子对接发现，AMPK/mTOR/ULK1信号通路介导的细胞自噬之间可能存在干预机制，但仍缺少有效研究及验证。因此，本研究通过体外实验验证理冲生髓饮通过调控AMPK/mTOR/ULK1信号通路对卵巢癌细胞自噬的作用机制。

随着研究的发展，自噬在多种疾病的形成中发挥重要作用[9,10,11]。自噬相关因子主要包括Beclin-1、LC3及P62。Beclin-1是自噬的正向调节因子，Beclin-1蛋白水平的下调可以降低自噬水平；LC3是酵母自噬相关蛋白(ATG)8在哺乳动物中的同源蛋白，是自噬体膜上的标志性蛋白，在自噬体形成过程起到非常关键的作用。LC3的羧基端能够被ATG4酶切形成LC3-Ⅰ,LC3-Ⅰ在ATG3和ATG7的作用下与磷脂酰乙醇胺反应形成LC3-磷脂酰乙醇胺(即LC3-Ⅱ)。LC3-Ⅱ能够与新形成的膜结合，直到自噬溶酶体的形成[12,13]。因此，LC3-Ⅱ常用作自噬形成的标识物，也是一种重要的定位于自噬泡膜上的多信号传导调节蛋白。P62蛋白被认为是一种自噬特异性底物。P62通过LC3相互作用区与LC3-Ⅱ相互作用形成复合物而被募集到自噬体中，并通过自噬溶酶体进行有效降解[14,15]。当自噬被抑制时P62积累增加，而自噬被诱导时可观察到P62水平降低[16]。AMPK/mTOR/ULK1信号通路被认为是自噬的一个非常关键的调控通路[17,18]。

本研究结果表明，LCSSY可以降低Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ的表达，而提高P62的表达，SKOV3细胞的自噬水平下降。在此基础上，继续探索其干预自噬的机制，发现LCSSY能够抑制AMPK信号通路，促进mTOR活化，下调ULK1表达以降低SKOV3细胞自噬水平，当运用AMPK激活剂来逆转AMPK/mTOR/ULK1信号通路后，发现SKOV3细胞自噬水平升高，说明LCSSY通过调控AMPK/mTOR/ULK1信号通路影响SKOV3细胞自噬水平。

由此可见，LCSSY治疗卵巢癌是通过多成分、多靶点、多通路实现，其作用机制可能是通过抑制细胞异常增殖和调控细胞自噬等实现。然而本研究仅从体外水平研究了理冲生髓饮对卵巢癌细胞自噬的影响及其调控的信号通路，在未来的研究中，课题组将进一步从动物模型体内实验验证方面深入研究LCSSY对卵巢癌自噬的影响。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献：

[3]杨霖，王笑民，杨国旺，等.“虚、痰、瘀、毒”在卵巢癌发生发展及转移过程中的理论探讨[J].时珍国医国药，2018,29(8):1951-1952.

[4]沈影，韩凤娟，王秀霞.“温煦肾阳，搜剔胞络瘀滞”理论提出、应用及发展的思考[J].中华中医药杂志，2020,35(3):1336-1339.

[5]李洋.复方理冲生髓饮的谱效学研究[D].哈尔滨：黑龙江中医药大学，2015

[8]张兴莉，周钱梅，陆奕宇，等.上皮间质转化在卵巢癌耐药中的作用及中药干预研究进展[J].上海中医药杂志，2023,57(6):20-25.

[9]成小蓉，刘蕊蕊，潘飞飞，等.磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白自噬通路在支气管肺发育不良中的作用[J].中国医药，2023,18(8):1165-1169.

[10]赵宝银，张丽霞，梁昭君，等.自噬、凋亡及焦亡在胃癌发生发展中的研究进展[J].中国临床医生杂志，2022,50(4):408-410.

[11]张艳芹，路攀，吴迪，等.卵巢癌中自噬的分子改变[J].中国医刊，2018,53(4):370-372.

基金资助:国家自然科学基金(82074484、82274566)~~；

文章来源:刘芳媛,丁丹妮,郭滢,等.理冲生髓饮有效组分调控相关信号通路对卵巢癌自噬的影响研究[J].中国医药,2024,19(05):659-663.