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磐龙玉热疗对风寒湿痹型膝骨关节炎抗炎镇痛作用的实验研究

2025-05-19 120 上传者：管理员

摘要：目的:研究吉林磐龙玉热疗对风寒湿痹型膝骨关节炎(KOA)的抗炎镇痛作用，为中医矿物药在风寒湿痹症中的应用提供理论支持。方法:选择SPF级6周龄雄性SD大鼠20只，随机分为空白组、模型组、磁石组和磐龙玉组(各5只)。除空白组外，其余各组均采用改良Hulth法建立膝骨关节炎模型且术后第2周开始放入人工气候箱进行风寒湿干预。磁石组和磐龙玉组分别使用加热后的磁石和磐龙玉进行每日30 min的热疗，持续4周。干预结束后，用Von Frey纤维丝测定爪缩回疼痛阈值；利用DigiGait成像系统测量步态参数；用激光散斑成像系统检测膝关节血流灌注量；用聚合酶链式反应(PCR)检测背根神经节中降钙素基因相关肽(CGRP)、瞬时受体电位香草酸亚家族成员1(TRPV1)、神经肽物质P(Substance P)、P75神经生长因子(P75)、神经肽Y(NPY)、转化生长因子-β(TGF-β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等疼痛及炎症相关基因的表达；用病理染色法观察关节破坏情况。结果:与模型组相比，在磁石及磐龙玉热疗干预后症状得到改善，且磐龙玉干预后改善效果更显著，差异有统计学意义(P<0.05);磁石组及磐龙玉组足爪面积、制动时间及步幅明显增加，摆动时间明显缩短，其中磐龙玉组改善更明显，差异有统计学意义(P<0.05);与空白组相比，模型组膝关节周围血流灌注明显减少，而磐龙玉热疗显著恢复了膝关节周围血流灌注，差异有统计学意义(P<0.05);磐龙玉干预下调了大鼠背根神经节(DRG)组织中CGRP、TRPV1、Substance P、P75、IL-6和TNF-α等炎症及疼痛基因的相对表达水平，差异有统计学意义(P<0.05),但对NPY和TGF-β的表达水平无明显影响。结论:磐龙玉热疗具有活血化瘀、抗炎镇痛作用。

关键词：
中医疗法
热疗
磐龙玉
风寒湿痹
骨关节炎
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骨关节炎易发于负重大､活动多的部位,膝骨关节是最常见的易发部位之一[1]｡中医认为膝骨关节炎(KneeOsteoarthritis,KOA)属于“痹证”范畴,以膝关节处的疼痛､麻木､僵硬及活动障碍为主要特征[2]｡目前风寒湿痹型膝骨关节炎的中医治疗原则以祛风散寒､活血通络为主[3]｡现代研究表明,玉石在提供微量元素､促进血液循环及改善心脑血管疾病方面具有积极效果[4-6]｡磐龙玉是一种产自吉林省磐石市龙岗山脉的稀有高品质玉石,石英和绢云母是其主要矿物成分[7]｡而据《本经》记载,石英主消渴､阴萎､咳逆,具有治疗肺寒咳喘､心神不安､风寒湿痹等症状的功效｡鉴于玉石可改善微循环以及磐龙玉治疗风寒湿痹症的效果,本研究建立了风寒湿痹型膝骨关节炎模型,采用磐龙玉热疗法干预,探索其通过释放热量缓解关节局部寒湿积滞对风寒湿痹型膝骨关节炎的镇痛作用,现报告如下｡

1、材料和方法

1.1实验动物

SPF级6周龄SD大鼠20只,雄性,体重为180~200g,由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供,实验动物使用许可证编号为SYXK(沪)2020-0009｡实验动物饲养于上海中医药大学实验动物中心SPF动物饲养室,环境温度控制在23℃左右,相对湿度为40%~70%;交替进行12h光照和12h黑暗,自由饮水和进食｡本实验所用实验动物和实验设计均由上海中医药大学实验动物福利和伦理委员会动物实验伦理审查批准(PZSHUTCM2405060012)｡

1.2实验材料

异氟烷购自中国瑞沃德公司;脱毛膏购自英国Veet公司;RNAeasyTM动物核糖核酸(RNA)抽提试剂盒(离心柱式)购自中国碧云天公司;EvoM-MLV反转录预混型试剂盒和SYBR GreenProTaqHS预混型qPCR试剂盒(含ROX)购自中国艾科瑞生物公司;磁珠购自东莞市飞鸿磁业有限公司;磐龙玉由上海中医药大学磐龙玉矿物药国际研究院提供｡

1.3实验仪器

人工气候箱购自上海三腾仪器有限公司;DigiGait成像系统购自美国MouseSpecifics公司;VonFrey纤维丝测痛仪购自上海玉研科学仪器有限公司;多通道小动物麻醉机和激光散斑血流成像系统购自中国瑞沃德公司;酶标仪购自美国BioTek公司;超低温冷冻储存箱购自中国美菱公司;QuantStudio3荧光定量PCR仪购自美国ThermoFisherScientific公司｡

1.4方法

1.4.1实验动物分组

实验用大鼠在经过1周适应性喂养后,按体重用随机数字表法分为4组,即空白组､模型组､磁石组及磐龙玉组,每组各5只｡除空白组无干预措施外,其余3组采用改良Hulth法建立大鼠膝骨关节炎模型,同时在术后第2周开始放入人工气候箱每日干预8h,连续造模4周[8]｡在此基础上,磁石组和磐龙玉组分别使用加热后的磁石和磐龙玉对大鼠进行热疗｡

1.4.2实验动物造模及干预方法在实验过程中,所有组别的大鼠都在相同条件下接受标准化饲料喂养,可以自由摄取食物和水｡

空白组:提前准备手术器械,高温灭菌消毒并烘干;异氟烷气体麻醉动物后,使用脱毛膏去除膝关节周围毛发;用碘伏对大鼠右膝关节消毒;在大鼠右侧膝关节纵行切开皮肤,随后缝合｡

模型组:采用改良Hulth法制备膝骨关节炎模型｡提前准备手术器械,高温灭菌消毒并烘干;异氟烷气体麻醉动物后,使用脱毛膏去除膝关节周围毛发;用碘伏对大鼠右膝关节消毒;在大鼠右侧膝关节纵行切开皮肤､韧带及关节囊,切断大鼠膝关节前交叉韧带和内侧副韧带,摘除内侧半月板,前抽屉试验检验前交叉韧带是否切断｡风寒湿干预模型:术后第2周开始进行寒湿干预,将大鼠放入人工气候箱,设置湿度95%､温度4℃和风力3级,每天干预8h,连续干预4周｡

磁石组:造模方式与模型组相同;利用磁性把磁珠串为圆环,将磐龙玉打磨加工为圆球形态,随后使用弹性绳把圆球串为圆环,采用金属浴对磐龙玉加热,加热温度恒定至42℃(使用红外测温仪检测),将加热好的磁石及磐龙玉圆环套至大鼠关节炎部进行热疗(见图1),30min/次,1次/d,连续治疗4周｡

1.4.3用VonFrey纤维丝检测大鼠疼痛测试前将

大鼠放置于机械痛检测环境适应30min;用纤维丝检测大鼠后足趾中心部位,共检测6次,每次间隔5min;用up-down法计算爪缩回疼痛阈值｡

1.4.4用DigiGait成像系统检测大鼠步态

评估前大鼠跑台适应性训练1周;检测时大鼠可自由穿行在固定长度的透明跑带上,跑带速度为10m/min,在透明跑带下方对动物成像来简化运动学观察和分析;分析处理数据,提供包括踏步次序模式､步幅长度､节奏和脚爪布局等量化步态信号参数｡

1.4.5用激光散斑成像系统检测大鼠膝关节周围血流灌注量

用异氟烷气体麻醉动物,使用脱毛膏去除膝关节周围毛发;将动物固定于黑色不透光板,膝关节位置处于拍摄视野中央;调整拍摄模式､拍摄高度､对焦距离､拍摄间隔时间､拍摄时间等;选择感兴趣区域(ROI)分析膝关节周围血流灌注量｡

1.4.6用qRT-PCR检测mRNA表达

用异氟烷气体深度麻醉大鼠,剪开背皮后,从脊柱的第2胸椎和髂骨处剪断脊柱,剔除附着肌肉,确定脊柱T1段,取出L4~6段腰膨大处脊柱,用手术刀沿中线切开,用解剖镊小心剥去脊髓,分离L4/5脊髓节段背根神经节(DRG),置于液氮中充分研磨,用RNAeasyTM动物RNA抽提试剂盒(离心柱式)提取组织中的总RNA｡用EvoMMLV反转录预混型试剂盒,将RNA反转成cDNA,具体操作参照说明书进行｡逆转录完成后,加入180μL去离子水将cDNA稀释10倍｡加入5μLcDNA､1μL引物､4μL去离子水和10μL2×SYBRGreen配制成20μL反应体系至八连管中,将八连管以2000r/min离心5min｡上机反应条件以95℃30s,95℃5s和60℃30s执行40个循环,95℃15s,60℃1min,95℃15s;实验结束导出数据｡各基因的引物序列见表1｡

表1qRT-PCR引物名称及序列图1对大鼠行磁石和磐龙玉干预治疗

1.5统计学方法

实验数据采用SPSS26.0软件进行统计分析,用GraphPadPrism9.0画图,采用x±s形式表示｡当数据符合正态分布且方差齐时,采用单因素方差分析(One-WayAnova)进行多组间比较｡若数据不符合正态分布或方差不齐,采用秩和检验(Kruskal-Wallis)进行非参数多组间比较｡检验水准α=0.05,P<0.05差异有统计学意义｡

2、结果

2.1各组大鼠爪缩回阈值比较

用VonFrey纤维丝检测结果显示,与模型组相比,磁石组及磐龙玉组爪缩回阈值升高,且磐龙玉组爪缩回阈值升高更明显,差异有统计学意义(P<0.05),见表2｡

表2各组大鼠爪缩回阈值(x±s)

2.2各组大鼠步态参数比较

DigiGait成像系统分析显示,与模型组相比,磁石组及磐龙玉组触爪面积､制动时间及步幅明显增加,摆动时间明显缩短,且磐龙玉组变化更明显,差异有统计学意义(P<0.05),见表3｡

表3各组大鼠步态参数分析结果(x±s)

2.3各组大鼠膝关节周围血流灌注量比较

激光散斑成像系统检测显示,与模型组相比,磁石干预后,大鼠患肢膝关节周围血流灌注量没有明显差异,而磐龙玉组大鼠患肢膝关节周围血流灌注量明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),见图2｡

图2各组大鼠膝关节周围血流灌注量

2.4各组大鼠背根神经节疼痛相关指标mRNA表达

根据qRT-PCR检测的Ct值,通过2ΔΔCt法计算相对于空白组相关基因的相对表达水平,见表4｡结果显示,与模型组相比,磐龙玉干预下调了大鼠背根神经节组织中降钙素基因相关肽(CGRP)､瞬时受体电位香草酸亚家族成员1(TRPV1)､神经肽物质P(SubstanceP)､P75神经生长因子(P75)等疼痛相关指标及白细胞介素-6(IL-6)､肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎症因子的相对表达水平,差异有统计学意义(P<0.05);同时,与模型组相比,磐龙玉干预后神经肽Y(NPY)和转化生长因子-β(TGF-β)的表达水平无明显差异｡

表4各组大鼠背根神经节疼痛相关基因的相对表达水平(x±s)

3、讨论

骨关节炎属于慢性退行性疾病,以关节软骨退变､滑膜增生和软骨下骨改变为主要病理特征[9]｡如《素问·痹论篇》所述:“风寒湿三气杂至,合而为痹也｡”《杂病源流犀烛》也提到:“风､寒､湿入于经络,致气血凝滞,津液稽留……正邪交战,故作痛不止也｡”中医理论认为机体正气不足,风､寒､湿三邪乘虚入体,引起经络痹阻,气血瘀滞｡所谓不通则痛,正邪交战于膝关节处,引发疼痛症状｡相关研究指出,临床上膝骨关节炎患者也有类似冷痛的感觉,这种现象的原因可能与膝关节周围血液和淋巴循环不畅､微循环存在障碍有关[10-11]｡目前中医对膝骨关节炎常用的治疗方法包括中药汤剂等内治法,以及拔罐､针灸､热疗等外治法[12-15]｡其中,热疗作为一种传统的中医外治法,方便易实施,可直接深入患处达到活血化瘀的目的[16]｡临床研究证实磁热疗和塌渍热疗等方式可通过温经散寒､活血通络､化湿止痛来缓解风寒湿痹症状[17-20]｡我国矿石药物的应用已有2000多年历史,《黄帝内经》和《本草纲目》均记载玉石具有“柔筋骨,长肌肉,利血脉”等疗效｡因此,磐龙玉热疗可将热疗与药疗融于一体,从而促进局部血液循环及骨质营养代谢,实现温经散寒､活血化瘀､除痹止痛的效果｡

前期研究发现风寒湿邪干预会加重膝骨关节炎,促使温感通路瞬时受体电位A1(TRPA1)､瞬时受体电位Melastatin离子通道成员8(TRPM8)､瞬时受体电位香草酸亚家族成员1等基因蛋白及炎性因子的表达升高[21]｡本实验在此基础上建立了风寒湿痹型膝骨关节炎模型,并设置磁石热疗组作为对照以排除磁石热效应的影响,验证磐龙玉热疗干预的效果｡爪缩回疼痛阈值显示,造模后大鼠患肢疼痛反应明显,并且在磁石及磐龙玉热疗干预后得到改善,且磐龙玉干预后改善效果更显著｡步态参数作为疼痛评估的依据,显示模型组患肢制动时间缩短､摆动时间延长､步幅明显下降,这与相关文献报道的慢性疼痛症模型中步态变化一致[22-23]｡经磐龙玉热疗干预后大鼠的疼痛程度明显减轻,步态异常得到改善｡各组大鼠疼痛阈值及步态数据的对比提示磐龙玉具有显著的抗炎镇痛作用｡背根神经节中包含了多种参与疼痛敏感的免疫因子和膜蛋白受体,为了揭示磐龙玉热疗的作用机制,采用qRT-PCR检测背根神经节中与疼痛相关的指标｡磐龙玉干预后,背根神经节中降钙素基因相关肽､瞬时受体电位香草酸亚家族成员1､神经肽物质P､P75神经生长因子､白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α的表达均显著下降,表明磐龙玉可能通过下调这些疼痛相关因子的表达来起到镇痛效果｡此外,为进一步探索磐龙玉热疗的镇痛机理,本研究采用激光血流散斑技术检测大鼠膝关节周围的血流量｡与空白组相比,模型组大鼠的微循环阻滞､疼痛加重｡磐龙玉干预后大鼠膝关节周围的微循环显著改善,提示磐龙玉热疗的镇痛作用可能与其促进血液循环､疏通经络的作用密切相关｡

综上所述,本研究明确了磐龙玉热疗具有活血化瘀､抗炎镇痛作用,这一发现为矿物药在中医药治疗骨关节炎中的应用提供了理论依据｡

参考文献:

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基金资助:国家自然科学基金项目(81902306,82174406);上海中医药大学科技发展项目(23KFL023);上海健康医学院附属周浦医院院级人才项目(ZPRC-2024A-05);

文章来源:朱志恒,丁佳滢,曹昱,等.磐龙玉热疗对风寒湿痹型膝骨关节炎抗炎镇痛作用的实验研究[J].中国中医骨伤科杂志,2025,33(05):1-5+12.