呼吸道病毒感染疾病是人类最常见的疾病之一，严重威胁人们的生命健康[1]。引起感染的呼吸道病毒主要包括流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒和冠状病毒等[2]。近年来，全球范围内逐渐出现一些引起呼吸道感染的新型高致病性病毒，病死率普遍较高，如严重急性呼吸综合征（SARS)、中东呼吸综合征（MERS）、甲型H5N1人禽流感病毒和新甲型H1N1流感病毒等，以及2019年底开始在世界范围内大流行的新型冠状病毒肺炎（COVID-19），都对全球公共卫生构成了巨大威胁[3]。

在现代医学中，主要使用金刚烷类（如金刚烷胺、金刚烷乙胺）和神经氨酸苷酶抑制剂（如扎纳米韦和奥司他韦）作为抗流感病毒药物，而对于其他呼吸道病毒尚无有效的针对性治疗手段，多采用广谱抗病毒药物或激素治疗，但广谱抗病毒药物耐药率高[2]；激素治疗虽然能在短时间内减轻炎症反应，降低治疗失败的发生率，但可能伴随着侵袭性真菌感染、骨坏死等风险[4]。中医将呼吸道病毒感染辩证为感冒、咳嗽、风湿肺热等，中药治疗此类疾病主要优势不在于抗病毒，而是调整人体免疫状态[5]。在2003年抗击SARS过程中已经初步体现了中药治疗呼吸道病毒感染的优势[6]，如减少继发真菌感染、缩短发热时间、减轻肺部炎症等。此次抗COVID-19的过程中，国家和地方均将中医药纳入诊疗方案，在对症治疗的同时益气扶正、顾护脾胃，贵州省中医药管理局在《贵州省新型冠状病毒肺炎中医药防治参考方案（第二版）》中将儿童回春颗粒作为COVID-19轻症中成药的推荐用药[7,8,9]。中药治疗呼吸道病毒感染具有良好的应用前景。

临床试验证实了儿童回春颗粒在治疗小儿上呼吸道感染具有良好效果，且安全性好[10,11]；同时，也有研究表明儿童回春颗粒对感冒引起的消化道症状、轮状病毒引起的肠炎等有明显改善作用[12,13]。儿童回春颗粒由水牛角浓缩粉、羚羊角、防风、升麻、荆芥等20味中药组成，主要功效为清热解毒、透表豁痰；用于急性惊风、伤寒发热、临夜发烧、小便带血、麻疹隐现不出引起的身热咳嗽以及赤痢、水泻、食积、腹痛等消化道疾病[14,15]。但儿童回春颗粒发挥抗病毒作用的机制尚未明确。因此，本研究采用网络药理学方法和分子对接技术探索儿童回春颗粒治疗呼吸道病毒感染疾病的作用机制，为其在呼吸道病毒感染性疾病的临床使用提供理论参考。

1、材料与方法

1.1成分信息

通过TCMIP[16]数据库并结合文献调研，查询儿童回春颗粒中的药材的性味归经信息。在TCMSP[17]数据库中以口服生物利用度（OB)>30%、类药性（DL)>0.18,BATMAN-TCM[18]数据库中以默认值（Score cutoff>20、P<0.05）为筛选条件，同时结合文献检索，得到儿童回春颗粒组方药材的潜在有效成分。

1.2潜在靶点库的建立

在Pub Chem数据库中查询有效成分的SMILES字符串，并将其输入Swiss Target Prediction网站[19]进行化合物的靶点预测，建立儿童回春颗粒成分靶点库。

通过文献检索汇总常见呼吸道病毒，在Gene Cards[20]数据库中分别以“influenza virus”“human parainfluenza virus”“respiratory syncytial virus”“measles virus”“rubella virus”“MERS-Co V”“SARS-Co V”“HCo V-229E”“HCo V-OC43”“HCo V-NL63”“HCo V-HKU1”“ECHO virus”“coxsackie virus”“cytomegalovirus”“rhinovirus”“adenovirus”“human metapneumovirus”为关键词搜索，选取评价分数大于10分的靶点建立呼吸道病毒感染靶点库。

利用将中药成分靶点与呼吸道病毒靶点进行交集得出二者共同靶点，作为儿童回春颗粒治疗呼吸道病毒感染的潜在靶点。

1.3富集分析

将潜在靶点列表导入DAVID[21]数据库，物种选择为“Homo sapiens”，进行结合基因本体论（gene ontology,GO）分析和京都基因和基因组百科全书通路分析，利用在线工具Image GP将其结果可视化。

1.4网络构建

根据“1.1”项中得到的药材归经信息，利用Cytoscape 3.7.1软件[22]构建中药-归经网络图；将药材-成分和成分-潜在靶点关系导入Cytoscape 3.7.1软件中利用Merge功能构建药材-成分-潜在靶点网络图，并进一步分析网络度（degree）值，以degree值较高的成分作为候选药效成分用于分子对接。

1.5分子对接

在TCMSP数据库中下载儿童回春颗粒候选药效成分的3D结构信息；在Pubchem数据库中下载临床抗呼吸道病毒感染药物3D结构信息；在PDB数据库中下载呼吸道病毒的候选靶点蛋白的3D结构，并导入Autodock Tool[23]软件对靶蛋白进行清除配体、水及加氢、加电等修饰。最后利用Autodock 4.0，将候选药效成分、候选抗病毒药物与经前处理后的靶蛋白进行对接运算分析，对接运算采用拉马克遗传算法，具体参数设置为以蛋白活性口袋作为盒子的中心坐标，格点数为6 nm×6 nm×6 nm，格点距离间隔为0.037 5 nm，其余为默认参数。

2、结果

2.1中药-归经分析

根据TCMIP数据库和文献检索搜集并分析儿童回春颗粒复方中的中药归经信息，并构建中药-归经网络图，见图1。连接度较大的经络为肺（lung）、胃（stomach）、肝（liver）、心（heart）、脾（spleen）等经络；连接度较大的药物为黄芩、黄连、升麻、地黄、川木通等药物。

图1中药-归经网络

2.2儿童回春颗粒成分库建立

根据TCMSP数据库和BATMAN-TCM数据库同时结合文献检索，最后共得到儿童回春颗粒的126个有效成分，见表1。

表1儿童回春颗粒的有效成分

2.3潜在靶点库的建立

在Swiss Target Prediction网站上传中药成分结构信息后进行化合物的靶点预测，根据预测得分选取每个成分前20个靶点纳入成分靶点库中，最后去除重复结果共得到儿童回春颗粒有效成分的作用靶点603个。

通过文献检索汇总引起呼吸道感染的病毒，见表2，病毒的种类主要包括正粘病毒科、副粘病毒科、冠状病毒、肠病毒和其他病毒，通过Gene Cards数据库检索得到呼吸道病毒感染相应靶点，根据评价分数大于10进行筛选，最终获得402个重要靶点。

将儿童回春颗粒成分靶点与呼吸道病毒靶点进行交集，得出二者共同靶点55个，如图2所示，作为通路富集和及网络研究的候选靶点。

2.4富集分析

将共有靶点列表导入“DAVID”数据库后得到富集分析结果，根据P值大小筛选出前10条KEGG通路（图3）和前10条GO生物过程条目（表3）。KEGG通路图中，纵坐标代表富集的通路名称，横坐标为每条通路上的基因数占共有靶点的比例。

表2引起呼吸道感染的常见病毒

图2儿童回春颗粒成分靶点与呼吸道病毒靶点的共有靶点

图3 KEGG通路分析气泡图

表3 GO生物过程富集分析

由图3可知，55个共同靶点主要富集在癌症相关通路、乙型肝炎及丙型肝炎相关通路、PI3K-Akt信号、TNF信号通路以及HIF-1信号通路等；由表3可知，涉及到的主要生物过程包括炎症反应、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、肽基丝氨酸酸磷酸化、脂多糖介导信号通路、缺氧反应、伯格曼胶质细胞分化、骨化调节、失巢凋亡负性调节等生物过程。

2.5网络构建及网络分析

利用Cytoscape 3.7.1软件构建药材-成分-共有靶点网络图（图4）、潜在靶点-通路网络图（图5），其中黄色节点代表药材，蓝色节点代表药效成分（S1-S126），红色节点代表成分与呼吸道病毒感染的共同靶点，紫色节点代表富集通路。

在药材-成分-潜在靶点网络图中，来自18味药材中的126个成分能够作用于55个靶点，这体现了中药复方多药材-多成分-多靶点的作用特点，通过分析发现degree较高的成分主要包括S31（没食子酸）、S84(7,8-二羟基升麻醇）、S87（升麻素苷）、S88（升麻醇）、S121（珊瑚菜素）、S124（菠菜甾醇）、S110（黄芩苷）、S27(8-甲氧基异欧前胡内酯）、S25（大豆素-4′,7-二葡萄糖苷）、S2（穆坪马兜铃酰胺）、S1（广玉兰内酯）等，这些成分主要来自升麻、赤芍、黄芩、黄连、前胡、羌活、葛根等；而药材-成分-潜在靶点网络图中degree较高的靶点主要包括前列腺素内过氧化物合酶（PTGS2）、表皮生长因子受体（EGFR）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、白细胞介素2(IL2）、β-分泌酶1(BACE1）等。在潜在靶点-通路网络图中，发现PTGS2、MAPK、IL2、EGFR均富集在重要通路中包括癌症相关通路、肝炎相关通路、TNF信号通路和PI3K-Akt信号通路。

图4药材-成分-潜在靶点网络图

图5潜在靶点-通路网络

2.6分子对接

为了进一步验证网络的预测能力，本研究拟采用分子对接技术手段探讨儿童回春颗粒用于治疗呼吸道病毒感染疾病的可能性。在药材-成分-共有靶点网络图中选取degree较高的前5个成分包括没食子酸、7,8-二羟基升麻醇、升麻素苷、升麻醇、珊瑚菜素（主要来自于升麻、赤芍、前胡、羌活）作为候选对接药效成分；选取degree较高的靶点PTGS2、MAPK（多种呼吸道病毒的共有靶点）以及ACE2、3CL水解酶（3CLpro)[24]（冠状病毒感染的重要靶点）作为候选对接靶点，进行分子对接。同时，选取广谱抗病毒药物利巴韦林作为参照，对接结果见表4。成分与靶点的结合能和形成氢键数量是评价结合能力的重要指标，通常认为结合能越低亲和力越强、氢键数量越多则结合越稳定。从对接结果来看（表4、图6），来自升麻的7,8-二羟基升麻醇、升麻素苷及升麻醇与PTGS2、MAPK、ACE2、3CLpro的结合能相对较低，即这些成分与4个靶点的结合能力较强，除7,8-二羟基升麻醇未能与MAPK、3CLpro形成氢键，稳定性欠佳外，其余均能形成氢键增强稳定性。另外值得注意的是，候选对接成分与4个靶点的结合能均低于利巴韦林，表明这些成分与靶点的亲和力要更强，但利巴韦林与靶点蛋白形成的氢键数量相对较多，可能具有良好的稳定性。基于以上结果，儿童回春颗粒中的代表性成分与呼吸道病毒感染疾病的靶点结合能力较强，表明儿童回春颗粒对呼吸道病毒感染具有治疗作用。

表4儿童回春颗粒核心成分和利巴韦林与靶点的结合情况

图6核心成分与靶点对接示意图

A-ACE2-7,8-二羟基升麻醇B-ACE2-升麻醇C-3CLpro-升麻素苷D-PTGS2-7,8-二羟基升麻醇E-PTGS2-升麻素苷F-MAPK-升麻素苷

3、讨论

3.1儿童回春颗粒与肺系疾病

中医药的性味归经是基于中医药基础理论以及临床经验而产生的，特定性味的药物具有特定作用，而归经则使药物对其特定的脏腑经络产生治疗作用。儿童回春颗粒组分的药性大多寒凉，可清热透表。中医认为，辛能发散表邪，苦能燥湿降泄，甘可补虚缓急，咸可软坚散结。肺系疾病治疗的关键环节为发表散邪，本方味以辛、苦为主，兼有甘、咸，即以辛味为主的儿童回春颗粒能够在呼吸道疾病中发挥作用，同时具有燥湿作用的中药也可尝试治疗以“湿”为主、病变在肺脾的COVID-19。尤其甘味补虚，从现代医学角度讲则是提高免疫力，也是儿童回春颗粒可能在预防、治疗呼吸道病毒感染疾病过程中的关键。而中药-归经网络显示20味中药主要与肺、胃、心、肝、脾关联，佐证了儿童回春颗粒对以呼吸道症状为主要表现的肺系疾病具有治疗作用；同时，对肝、脾、胃的治疗作用也能使肝气疏泄正常，促进脾胃功能恢复、气机正常升降，解除胸闷、脘痞或呕恶、便溏等伴随的消化道症状。

3.2儿童回春颗粒治疗呼吸道病毒感染疾病潜在有效成分

通过网络药理学研究发现没食子酸、7,8-二羟基升麻醇、升麻素苷、升麻醇、珊瑚菜素、菠菜甾醇、黄芩苷、8-甲氧基异欧前胡内酯、大豆素-4′,7-二葡萄糖苷、穆坪马兜铃酰胺、广玉兰内酯等成分可能是儿童回春颗粒发挥抗病毒作用的重要成分。研究表明没食子酸能通过对细胞膜的保护作用发挥抵抗大鼠急性肝炎的作用，并且对于乙型肝炎病毒也具有较好的抑制作用[25]，其衍生物表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对于流感病毒引起的肺炎能够明显减轻小鼠肺组织病变程度，降低病死率[26]；黄芩苷在体外实验已被证明对流感甲型病毒和柯萨奇B3型病毒感染有抑制细胞病变的作用[27]，在动物实验中发现其能够明显减轻甲型流感病毒性肺炎小鼠的肺纤维化现象，降低肺组织MAPK、核因子κB(NF-κB）、转化生长因子-β（TGF-β）蛋白的表达[28];7,8-二羟基升麻醇、升麻素苷、升麻醇均来自升麻，具有抑制核苷运转、抗病毒、抗肿瘤、消炎等多种生理活性，已被证明对多种呼吸道病毒有显著抑制作用[29]，升麻素苷同时也是防风中的重要抗炎成分，其与荆芥（同时也是儿童回春颗粒的一味药材）常配伍使用治疗外感表症。研究发现荆防散的正丁醇部分预防给药对于脂多糖（LPS）所致小鼠急性肺损伤模型和LPS刺激诱导的RAW264.7细胞炎症模型均具有较好的保护作用[30]。

目前，抗呼吸道病毒药物主要通过抑制病毒包膜上神经氨酸酶的活性阻止病毒扩散、抑制离子通道活磷酸次黄苷脱氢酶活性阻断病毒复制、利用干扰素诱生抗病毒蛋白等生物过程涉及到的相关靶点进行设计，PTGS2、MAPK是流感病毒、呼吸道合胞病毒、柯萨奇病毒、鼻病毒等多个呼吸道病毒的靶点，ACE2则是流感病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒等的重要靶点，同时ACE2与3CLpro也是研究SARS-Co V-2的重要靶点[31]。本研究通过分子对接技术，进一步验证了升麻中的升麻醇和升麻素苷与PTGS2、MAPK、ACE2和3CLpro之间具有良好、稳定的结合关系，提示儿童回春颗粒中的有效成分可能通过靶向PTGS2、MAPK、ACE2和3CLpro而发挥抗呼吸道病毒作用，并且对于COVID-19可能具有潜在治疗作用。

3.3儿童回春颗粒治疗呼吸道病毒感染疾病可能作用机制

冠状病毒感染轻则引起类似感冒的发烧、干咳等症状，重则会使患者出现呼吸窘迫综合征、休克、脓毒症甚至死亡，其在宿主细胞中通过激活PI3K-Akt通路或提高蛋白激酶磷酸化水平进而激活ERK-MAPK信号通路而完成病毒的复制和组装，通过激活细胞因子和化学趋化因子导致免疫过度应答而引发机体炎症和细胞因子风暴可能是主要致病机制[32]。SARS-COV-2同属于冠状病毒，其死亡尸体系统解剖观察报告中发现死者肺部损伤明显，出现灰白色病灶（炎性病变），肺切面可见大量黏稠的分泌物从肺泡内溢出，提示SARS-COV-2主要引起深部气道和肺泡损伤为特征的炎性反应[33]。

本研究通过KEGG通路分析和GO分析发现，儿童回春颗粒治疗呼吸道病毒感染的靶点主要富集在癌症、肝炎相关通路、PI3K-Akt信号、TNF信号通路和HIF-1信号通路等，主要涉及炎症反应、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、缺氧反应等生物过程。PI3K-Akt信号通路与宿主细胞的增殖、凋亡及免疫密切相关，病毒的入侵和复制可能是激活并利用PI3K-Akt信号通路完成，而在感染后可能通过降低其活性以躲避宿主的免疫防御[34];TNF是一种具有多种生物学效应的炎性介质，可以抑制病毒介导的细胞病变并降低病毒数量[35]；而HIF-1是一种低氧诱导因子，在低氧状态下其能激活多种靶基因的转录，是维持氧平衡的主要调节因子，其表达产物对于适应缺氧环境具有重要作用，研究表明病毒感染细胞的HIF-1的表达稳定性明显高于未感染细胞，当HIF-1的表达抑制后，病毒感染和糖蛋白表达均出现下降，病毒复制速度也明显减慢[36]。除此之外，网络中度值较高的靶点PTGS2、EGFR、MAPK、IL2等均与炎性反应或宿主细胞增殖具有密切联系。

由此可见，儿童回春颗粒可能主要通过降低炎性反应、调控PI3K-Akt通路干扰病毒入侵宿主及进行复制的过程，同时降低HIF-1的表达以进一步抑制病毒复制，而发挥治疗呼吸道病毒感染的作用。

本研究通过结合网络药理学及分子对接技术，发现儿童回春颗粒中的药材主要通过肺、胃、心、肝等经络及相关脏腑发挥作用，其中的没食子酸、7,8-二羟基升麻醇、升麻素苷、升麻醇、黄芩苷等成分能够通过靶向PTGS2、EGFR、MAPK、IL2等靶点调节PI3K-Akt信号、TNF信号通路和HIF-1信号通路，进而进一步影响炎症反应、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、缺氧反应等生物过程，而发挥治疗呼吸道病毒感染的作用。

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基金:广东省中医儿科重点建设单位项目(粤中医办函[2018] 202号).