骨质疏松症(osteoporosis, OP)是一种以骨量低下，骨组织微结构损坏，导致骨脆性增加，易发生骨折为特征的全身性骨病[1]。OP可以发生在任何年龄，但在临床上绝经后的女性和老年男性多见。此外，遗传因素和不良习惯也是发病率增加的危险因素[2]。雌激素、降钙素和双膦酸盐通常用于OP的缓解，但OP仍没有治愈的方法[3]。新的表观遗传热点，N6-Methyladenosine (m6A)是一种甲基化的腺苷核苷酸，m6A修饰影响骨代谢相关细胞的增殖、分化和凋亡，如骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cell, BMSCs),促进m6A发生的甲基转移酶METTL3和擦除m6A发生的去甲基转移酶FTO参与成骨分化和成脂分化的微妙过程，对OP的病理发展具有重要意义[4]。本研究基于“精气互化”理论，从m6A发生的“Writers”即甲基化转移酶METTL3切入，试探究填精益气法即鹿茸提取液联合黄芪甲苷诱导BMSCs向成骨分化的过程其表达变化的影响。

1、材料与方法

1.1实验对象

SD大鼠BMSCs(冻存次代P2),购于赛业(苏州),货号：RASMX-01001(同期课题组为同一批次细胞[5])。

1.2实验药物与试剂

药物：鹿茸提取液(鹿茸提取液为辽宁中医药大学实验室自制[5]);黄芪甲苷(生产批号：J25F10T81373,上海源叶生物科技有限公司)。

试剂：大鼠BMSCs完全培养基、大鼠BMSCs成骨诱导分化完全培养基和茜素红均购自赛业(苏州);Rat ALP ELISA kit(AMEKO,中国);PrimeScript® RT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR® Premix Ex Taq®Ⅱ(TliRNaseH Plus),ROX plus均购买于Takara公司[5];METTL3、WTAP、PPARγ一抗均购买于Cell Signaling。

1.3实验分组

实验分为5组：对照组(BMSCs基础培养基+10 mL/dL胎牛血清含100 U/mL青霉素链霉素)、诱导液组(BMSCs成骨诱导分化基础培养基+10 mL/dL胎牛血清含100 U/mL青霉素链霉素、谷氨酰胺+20μL地塞米松+10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠)[5]、填精组(基础培养基+10μg/mL鹿茸提取液，鹿茸提取液浓度由课题组前期实验所得[6])、益气组(基础培养基+10-8 mol/mL黄芪甲苷，药物浓度由同期浓度筛选实验所得)和填精益气组(基础培养基+鹿茸提取液+黄芪甲苷)。将BMSCs接种于30 mL 10%胎牛血清培养基中，置于37℃、体积分数为5% CO2的培养箱内静止培养传代，本次实验选取3、4代细胞。

1.4指标检测

1.4.1茜素红染色：

将BMSCs接种于成骨诱导培养基后放置于CO2培养箱中培养，观察其生长分布，应用茜素红染色法，干燥后镜下观察钙化结节及密度变化。

1.4.2 ELISA检测ALP:

具体方法按试盒说明进行。计算样品的实际浓度以μg/L表示(按说明书进行)。

1.4.3 qRT-PCR法检测基因表达：

提取细胞RNA,实时定量PCR检测METTL3、WTAP以及PPARγmRNA相对表达量。qRT-Real Time PCR所用引物序列见表1。

1.4.4 Western blot法检测蛋白表达水平：

使用BCA蛋白定量试剂盒对各组BMSCs样本进行蛋白定量，使用Image-J软件分析。

1.5统计学处理

采用SPSS 25.0软件处理数据，全部计量数据以均数±标准差(x¯±s)表示，P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示差异有显著统计学意义。

2、结果

2.1茜素红实验结果

钙化结节是鉴定成骨细胞分化成熟的特征性标志，如图1所示，为BMSCs诱导12 d的结果，各用药组细胞钙化结节生长较好、分布密集，且均优于对照组(A),根据钙结节数量和大小，由低到高依次为：对照组(A)<填精组(C)<益气组(D)<填精益气组(E)<诱导组(B),与ALP活性含量趋势一致。此外，各用药组对比，填精益气组(E)具有钙结节生长状态最好，结节数量多且密集的特点，也说明填精益气法联合使用更能够促使钙结节生长迅速且分布密集。

表1 qRT-Real Time PCR所用引物序列

图1各组大鼠12 d茜素红染色结果(100×)  

2.2 ALP活性的实验结果

检测各组BMSCs在6、12、18 d的ALP浓度。相同时间点各用药组ALP浓度由低到高依次为：填精组<益气组<填精益气组<诱导组，且在第12天达到高峰值，所以后续检测结果选用12 d样本进行检测。各时间点填精益气组ALP活性均优于填精组和益气组，见表2。

2.3 METTL3 mRNA及蛋白表达结果

qRT-PCR法检测结果显示，与对照组相比，各用药组METTL3mRNA表达均显著上调(P<0.01);各用药组间比较，其中与填精组、益气组相比，填精益气组METTL3的mRNA表达显著上调(P<0.01)。

Western blot法检测结果显示，与对照组相比，除益气组METTL3蛋白表达水平无明显变化(P>0.05)外，其他用药组的METTL3蛋白表达水平均显著上调(P<0.01);各用药组间比较，其中与填精组、益气组相比，填精益气组METTL3蛋白表达升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。

表2各组大鼠ALP活性比较(μg/L,x¯±s)

2.4 WTAP mRNA及蛋白表达结果

qRT-PCR法检测结果显示，与对照组相比，各用药组WTAP的mRNA表达均显著上调(P<0.01);各用药组间比较，其中与填精组相比，益气组和填精益气组WTAP的mRNA表达均显著上调(P<0.01),填精益气组WTAP mRNA表达水平最高。

Western blot法检测结果显示，与对照组相比，各用药组的WTAP蛋白表达水平上调，差异具有统计学意义，其中填精组(P<0.05),其他组(P<0.01);各用药组间比较，其中与填精组相比，益气组和填精益气组WTAP蛋白表达水平显著上调(P<0.01);与益气组相比，填精益气组WTAP蛋白表达升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。

2.5 PPARγmRNA及蛋白表达结果

qRT-PCR法检测结果显示，与对照组相比，各用药组PPARγ的mRNA表达均显著下调(P<0.01);各用药组间比较，其中与填精组相比，填精益气组PPARγ的mRNA表达下降，但差异无统计学意义(P>0.05);与益气组相比，填精益气组PPARγ的mRNA表达显著下调(P<0.01)。

Western blot法检测结果显示，与对照组相比，各用药组PPARγ蛋白表达水平下降，差异具有统计学意义，其中益气组(P<0.05),其他组(P<0.01);各用药组间比较，其中与填精组相比，益气组和填精益气组PPARγ蛋白表达水平下降，但差异无统计学意义(P>0.05);与益气组相比，填精益气组PPARγ蛋白表达水平明显下调(P<0.05)。

以上QRT-PCR检测结果见表3,Western blot检测结果见表4、图2。

表3各组大鼠METTL3、WTAP和PPARγmRNA表达水平比较(x¯±s)

表4各组大鼠METTL3、WTAP和PPARγ蛋白表达水平比较(x¯±s)

图2各组大鼠METTL3、WTAP、PPARγ和β-actin蛋白印记图  

3、讨论

3.1“精气互化”理论

“精气互化”理论首见于《黄帝内经》,阐述了精与气具有能生、能变、能化的功能。历代医家皆对其有所论述，明代著名医家张景岳在其《类经·阴阳类》云：“气归精(气者，真气也，所受于天，与谷气并而充身者也。人身精血，由气而化，故气归于精。)”。《类经·运气类》:“生之本，精与气耳，精能生气，气亦生精。”明确提出，气能生精，精又可以化气，精与气之间存在着互根互用的关系。精与气参与生命的构成，是调控人体生长壮老不断变化最基本的生命物质，二者之间又可以相互转化。

3.2基于“精气互化”理论防治OP

基于“精气互化”理论，精气亏虚是OP发生的基础病因病机。汪宏在其《望诊遵经·望诊》云：“是故阳化气，阴成形，精神为阳，骨骸为阴，且骨者髓之府，髓者骨之充，盛则见其筋骨劲强，衰则见其形容伛偻，骨损则见其骨痿”。阳化气，气养精，精生髓，髓盛则筋骨强劲。反之，精气亏虚则髓减骨损，随着精气亏虚程度的加剧，骨疾病逐渐加重，例如影响人体行动的骨痿，降低骨骼对人体支撑能力的骨极；骨骼无力、屈伸活动受限，甚者骨肉痿废无用的骨枯，从而导致OP的形成。现代研究提出BMSCs可被看作是肾精的部分体现。现代研究也表明OP患者多见于BMSCs成骨分化能力下降，成骨-成脂失衡，成骨-破骨细胞失偶联，骨量下降，骨脆性增加。因此，促进BMSCs更新、成骨分化是防治绝经后骨质疏松症的基本原则之一。因此本研究在中医理论指导下，通过体外实验，探究基于“精气互化”理论的填精益气中药对BMSCs成骨分化相关指标ALP及METTL3、WTAP和PPARγ表达的影响，同时将鹿茸提取液和黄芪甲苷配伍与单独应用进行比较，探讨填精益气中药对OP的作用机制。实验结果发现，鹿茸提取液联合黄芪甲苷对BMSCs成骨分化具有促进作用，且对BMSCs中PPARγmRNA及蛋白活性表达具有下调作用，提示应用填精益气法具有促进BMSCs成骨分化，降低成脂分化的作用，那么是否通过填精益气法达到填精壮骨，益气化膏，精气互济从而治疗OP,也有待于进一步研究。

3.3鹿茸联合黄芪甲苷与BMSCs成骨成脂分化研究

鹿茸，归肾、肝二经。《本草经集注·诸药集注》中提及“主益气、强志、生齿，不老。疗羸瘦，四肢酸疼，腰脊痛，”鹿茸作为血肉有情之品，具有补肾壮阳，益精填髓等功效。现代药理学分析，鹿茸多肽提取物对大鼠的骨密度、ALP活性以及骨代谢具有正向调节作用[7];鹿茸多肽和鹿茸多糖还能降低PPARγ2的活性抑制骨吸收[8]。黄芪，归脾、肺二经。《本草求真》中提及，黄芪为补气诸药之首，又称“耆”,具有补气升阳、生津养血等功效。同时有学者对近20年防治OP的用药规律进行汇总，在一众填精和补气中药中，黄芪脱颖而出，为防治OP的补气第一要药[9]。从多年的临床研究中得知，鹿茸以及黄芪甲苷在防治OP方面上具有安全且副作用小的优势。本研究观察鹿茸提取液、黄芪主要成分黄芪甲苷以及两者联合作用，精气互化，促进脾肾两者协同干预人体的运动功能，先天生后天，后天养先天，补气生精，精足髓充，骨骼强劲有力。本研究结果发现，鹿茸提取液、黄芪甲苷以及鹿茸提取液联合黄芪甲苷均可以使BMSCs向成骨细胞分化增强，向成脂分化减少。鹿茸提取液联合黄芪甲苷，在促进钙结节生长、提高ALP活性促成骨分化、降低PPARγ2抑制骨吸收方面均优于单独用药组，说明基于“精气互化”理论的填精益气中药鹿茸联合黄芪甲苷在促进BMSCs向成骨细胞分化、降低PPARγ2抑制骨吸收方面更具有优势。

3.4 m6A甲基化转移酶与BMSCs成骨分化

m6A作为表观遗传学研究的重要内容和前沿热点之一，近年来基于免疫沉淀和高通量测序方面的最新进展，学者们揭示了m6A修饰在细胞功能中的作用[10]。m6A修饰几乎发生在所有的生理和病理过程中，促进m6A甲基化修饰的Writers是由METTL3、METTL14、WTAP等组成[11]。其中METTL3调控细胞分化、生长、凋亡、转移和炎症等生物学过程[12]。最近研究报道，METTL3介导m6A甲基化调节BMSCs的成骨细胞分化[13]。METTL3表达变化可能抑制OP的发展[14]。因此，笔者尝试做了预实验，发现加入雌激素抑制剂后的BMSCs中，“Writer”身份的METTL3降低，促进BMSCs向成脂细胞分化增加，填精益气中药可以逆转这种变化，促进甲基化转移酶METTL3表达，从而提高m6A甲基化发生水平，因此本团队在前期研究工作基础上进一步行探索，本研究中各组METTL3、WTAPmRNA及蛋白表达水平趋势一致，与对照组相比，各用药组的METTL3、WTAP蛋白及mRNA表达水平呈上调趋势(P<0.01)。其中，鹿茸提取液联合黄芪甲苷对BMSCs中METTL3、WTAP蛋白及mRNA表达水平优于鹿茸提取液和黄芪甲苷单独使用，表明联合用药的效果优于单独用药，具有协同作用。也证明了通过填精益气中药及主要成分促进BMSCs成骨分化以及增强METTL3表达，在未来防治OP具有良好的研究前景，深入探索相关机制可为临床研究提供新的研究方向，为OP的研究带来潜在治疗靶点提供实验依据。

参考文献:

[5]王重一,邓洋洋,高巳东,等.基于Hippo信号通路探讨鹿茸提取液对BMSCs成骨分化的影响[J].中国骨质疏松杂志,2022,28(10):1496-1500.

[6]王庆谚.补肾益气活血方对绝经后骨质疏松症大鼠Wnt7b/B-catenin信号通路作用机制的研究[D].沈阳:辽宁中医药大学,2019.

[7]李斌,曹金霞,王保森,等,鹿茸多肽提取物抗去卵巢大鼠骨质疏松作用的研究[J.吉林中医药,2017,37(3):276-280.

[8]龚伟,郑洪新,李峰,等.鹿茸不同组分对去卵巢骨质疏松症大鼠的影响[J.时珍国医国药,2019,30(8):1819-1821.

[9]裘越,喻嵘,熊韬,武文洁.中医药治疗原发性骨质疏松的用药规律[J].中国骨质疏松杂志,2022,28(1):75-79.

[10]张旭,秦文,刘佳,等.m6A RNA甲基化修饰参与干细胞多向分化调控的研究进展[J].中华口腔医学研究杂志(电子版),2020,14(4):201-206.

基金资助:国家重点研发计划(2018YFC1704301);辽宁省自然科学基金面上项目(2020-MS-222);辽宁省教育厅重点攻关项目(LNKZZ20220103);沈阳市中青年科技创新人才支持计划(RC210129);辽宁中医药大学自然科学重点项目(2021LZY035);辽宁中医药大学中医脏象理论及应用教育部重点实验室开放基金(zyzx2201);

文章来源:邓洋洋,刘明欣,王重一等.填精益气中药对BMSCs成骨分化及甲基化转移酶METTL3的影响[J].中国骨质疏松杂志,2023,29(07):937-941.