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探究中药鹿血晶对骨髓间充质干细胞的增殖作用

2023-07-29 680 上传者：管理员

摘要：探究鹿血晶是否通过PI3K/AKT信号通路促进骨髓间充质干细胞(bone marrww-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)增殖。方法:通过MTT法检测不同鹿血晶药物浓度对细胞增殖影响，使用DAPI染色检测经药物刺激后的细胞数量，基于MTT法使用细胞周期实验检测细胞生长周期，通过Western blot实验检测PI3K与AKT的蛋白表达。结果:与对照组相比，鹿血晶浓度为200μg/ml时对BMSCs的增殖效果最佳，细胞数量明显增加(P<0.01),在第3天细胞生长进入对数生长期，第5天后开始逐步平稳。与对照组比较，各药物组的PI3K和AKT蛋白的表达均有提升。结论:鹿血晶作用于BMSCs,细胞数量显著增加，并且细胞中PI3K与AKT的蛋白表达提高。所以中药鹿血晶的促进BMSCs增殖作用可能是通过PI3K/AKT信号通路实现的。

关键词：
AKT
PI3K
仙灵骨葆
骨髓间充质干细胞
鹿血晶
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骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs),是大量存在于骨髓中的间充质干细胞[1]。可定向分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞和肝细胞等[2],并且具备自我更新能力，繁殖能力，能够迁移到损伤部位抑制氧化应激和炎症反应[3]。骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化一直是研究者们探究骨质疏松症治疗方法的重点领域，尤其是在调节免疫功能和炎症方面[4]。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)是存在于细胞质中的一类激酶，其下游蛋白磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)可以作为第二信使，能够将蛋白激酶B(AKT)募集到质膜上，使AKT发生磷酸化，实现对下游分子信号传导的诱导作用[5]。目前已有研究证明，基于PI3K/AKT信号通路可以实现对BMSCs的增长以及成骨向分化[6]。

鹿血，为鹿科动物梅花鹿(Cerrus nippen Temminck)或马鹿(Celaohus L)的血液。性热，甘咸，归肝、肾二经，具有行血祛瘀、养血益精、消肿疗伤等作用。《本草纲目》记载：“主阳痿、补虚，止腰痛……[7]中医认为“肾主骨生髓”,补肾的药物也具有一定的补骨功效。根据现代药理研究鹿血具有补精益气的功效[8]。故鹿血可能对骨骼起到保护作用。本实验将探究鹿血晶通过PI3K/AKT信号通路，对BMSCs增殖的影响。

1、材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1细胞

BMSCs,购于oricell公司，批号：RASMX-01001。

1.1.2药物

鹿血晶冻干粉末(贵州广济堂健康药业有限公司，批号：黔20170156);仙灵骨葆胶囊(同济堂，批号：Z200225337)。

1.1.3试剂

DMEM高糖培养基(Gibco公司，批号8122008);PBS(Solarbio公司，批号20210911);FBS(LONSA公司，批号RB01333);胰酶(Gibco公司，批号2186974);青霉素-链霉素溶液(双抗)(Gibco公司，批号129211);雅酶凝胶快速制备试剂盒(雅酶生物医药科技公司，批号02681250);MTT试剂盒(Solarbio公司，批号：M8180);DAPI试剂(Solarbio公司，批号：C0065);β-Actin(ABclonal公司，批号：9100006002);PI3K抗体(ABclonal公司，批号：A0266);AKT抗体(武汉三鹰公司，批号：10176-2-AP)。

1.1.4仪器

MK3型酶标仪(美国Thermo公司);3-18K型低温离心机(德国Sigma公司);倒置显微镜(德国Leica公司);君意牌蛋白凝胶电泳仪、Bio-Rad凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养

使用完全培养基(90%DMEM高糖培养基+10%胎牛血清),于37℃,5%CO2,100%湿度的培养箱中培养细胞。当细胞生长占培养瓶面积80%以上时，进行传代，取P3代进行实验。

1.2.2药物制备

称取1 g鹿血晶冻干粉末和1 g仙灵骨葆胶囊颗粒，溶于20 mL PBS溶液，再使用0.22μm孔径的过滤器过滤除菌，得到无菌的鹿血晶和仙灵骨葆母液(50 mg/mL),实验前用培养基稀释至所需浓度[9,10]。仙灵骨葆溶液浓度为250μg/mL,鹿血晶溶液浓度分别为400μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL。

1.2.3细胞增殖实验

将培养至P3代的BMSCs细胞接种至96孔板中，每孔1×104个细胞，设对照组(细胞加培养基)和鹿血晶组(细胞加含鹿血晶培养基),每组5个复孔。24 h后，去除培养基，各组加入对应含药培养基。药物刺激24 h后，避光加入MTT溶液，孵育4 h,每孔再加入DMSO150μL,室温振荡10 min。用酶标仪测定450 nm处各孔的吸光度(OD)值。根据公式：细胞存活率/%=(OD实验孔-OD空白孔)/(OD对照孔-OD空白孔)×100%,对照组存活率为固定值100%。挑选出促进细胞增长的最佳浓度。

1.2.4细胞生长周期检测

实验使用MTT法测量细胞生长周期。选取P3代BMSCs,将细胞每孔约1×104个细胞接种到96孔板，设对照组、仙灵骨葆组和鹿血晶组，每组3个复孔，分别加入对应培养基，共接种7块板。每天选择1块不同的96孔板加入MTT溶液(5 mg/mL),4 h后终止培养，吸出孔内上清，每孔加入DMSO150μL,室温振荡10 min,用酶标仪测定450 nm处各孔的吸光度(OD)值。连续测7天，以时间为横轴，吸光度为纵轴绘制细胞生长曲线。

1.2.5 DAPI染色实验

将BMSCs细胞每孔4×104个接种至24孔板中，根据不同组别，细胞经对应培养基干预24 h后，用4%多聚甲醛将细胞固定15 min, 1%曲拉通X-100打孔10 min, 1%BSA封闭1 h。DAPI试剂避光染色5 min后用荧光显微镜10×镜观察并拍照。

1.2.6 Western blot检测

离心提取不同组别的BMSCs,加入适量裂解液(RIPA:蛋白酶抑制剂：磷酸酶抑制剂=100:1:1),超低温离心机4℃、12 000 r/min离心15 min,提取BMSCs总蛋白。使用BCA蛋白检测试剂盒对提取的蛋白进行蛋白质定量。提取的细胞蛋白中加入上样缓冲液(总蛋白：上样缓冲液=4:1)100℃水浴10 min,部分蛋白放入-20℃冰箱保存备用。将蛋白转移至PVDF膜，0.05 g/mL脱脂奶粉封闭1 h;根据蛋白分子量不同，将带有蛋白印迹的PVDF膜加入对应一抗敷育，4℃过夜；第2天回收一抗，用TBST清洗PVDF膜3次，每次10 min,加入二抗敷育1 h;通过凝胶成像显影剂显示并拍下蛋白条带后分析。

1.2.7统计分析

DAPI染色实验和Western blot实验图片均采用image J软件处理，并得出数据。所有实验至少重复三次以上，证实每次实验的可重复性。使用GraphPad Prism软件对所有数据均进行正态性检验，并使用单因素方差分析。当P<0.05时，组间差异有统计学意义，当P<0.01时，则具有显著性差异。

2、结果

2.1细胞增殖实验结果与分析

通过图1,MTT实验结果显示，与对照组相比，设置鹿血晶的5个浓度中200μg/mL浓度的药物对于BMSCs的增殖效果最佳，并且这一效果随药物浓度减少而降低。相反继续增加药物浓度且药物浓度400μg/mL时，对于BMSCs细胞增殖不显著，考虑高浓度药物对于细胞具有毒性。而25μg/mL组几乎与对照组持平，促进增殖效果同样不显著，考虑药物浓度过低对于细胞增殖作用较小。所以接下来的实验采用最适浓度三个组分别为200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL作为鹿血晶药物组。

图1不同浓度的鹿血晶对于BMSCs的增殖影响

2.2细胞生长周期检测结果与分析

如图2所示，通过7天的细胞培养和吸光度测定发现，经药物的干预后，细胞在第3天开始进入对数生长期，在第4天药物干预作用逐渐明显。仙灵骨葆组与鹿血晶组的BMSCs增殖速度也在第3天后加快，鹿血晶组的细胞增长速度随药物浓度降低而逐渐减小，第5天后趋势开始逐步平稳。在第7天终止生长后，与对照组相比200μg/mL组的吸光度最高，100μg/mL组与50μg/mL组吸光度较小，但是以上均高于对照组。实验说明经鹿血晶干预后的BMSCs在培养第3天后生长效果最佳，所以接下来的实验检测采用培养3天后的BMSCs。

图2不同给药时间对BMSCs增殖吸光度的影响

2.3 DAPI染色实验结果与分析

通过图3可以看出，与对照组相比，仙灵骨葆组与鹿血晶给药组的细胞数量均有所增加，其中仙灵骨葆组与200μg/mL组细胞数量较多，而100μg/mL组数量居中，50μg/mL组数量较少。说明鹿血晶对BMSCs具有增殖作用，其中浓度为200μg/mL时效果最佳，且随药物浓度降低而效果减弱。

图3仙灵骨葆与不同浓度的鹿血晶对BMSCs数量表达的影响

2.4 Western blot检测结果与分析

由图4可得，仙灵骨葆组与200μg/mL组的PI3K蛋白表达高于其他各组；与对照组相比，100μg/mL的相关蛋白表达有所提高；而50μg/mL的蛋白表达较低，考虑药物浓度过低对于PI3K的表达影响不显著。仙灵骨葆组与鹿血晶各组均提高了AKT蛋白表达，其中仙灵骨葆组与200μg/mL鹿血晶组效果最显著，鹿血晶各组的蛋白表达与药物浓度呈正相关。以上说明一定浓度的鹿血晶可以上调PI3K与AKT的蛋白表达。

图4不同药物组的PI3K和AKT蛋白表达的比较

3、讨论

鹿血促进睾丸酮的含量的提升，提高机体性功能，增加性腺组织的重量，增加人体性激素分泌。对肾精不足、遗精早泄等疾病具有改善作用[11,12]。中医理论认为“肾主骨生髓”“肾精亏虚，骨髓化源不足”,补肾药物多具有补骨的功效。鹿血中含有钙、磷等微量元素，可以较好的补充骨骼中钙、磷含量，而丰富的氨基酸以及超氧化物歧化酶(SOD)可以抑制氧化带来的骨损伤[13]。在治疗骨质疏松症的研究中，如何促进BMSCs增殖以及成骨向分化是重点之一。BMSCs作为成骨细胞的前体细胞，可以通过分化增加成骨细胞数量，有效减少非病理性骨吸收，保持骨结构的完整性[14],缓解骨质疏松症。本实验从促进BMSCs增殖入手，MTT法筛选鹿血晶作用于细胞的药物浓度，发现50μg/mL～200μg/mL区间可以促进BMSCs增殖，其中以200μg/mL效果最佳；细胞生长周期实验则说明，经鹿血晶干预的细胞在第3天后进入对数生长期；结合以上两个实验结果，我们在后续的实验中采取200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL药物浓度以及培养至第3天的BMSCs。通过DAPI染色实验，我们可以看出不同组之间的细胞变化。我们使用image J软件分析灰度值后，与对照组相比较，仙灵骨葆组作为阳性药组有效的促进了BMSCs数量增长，而200μg/mL组的效果仅次于仙灵骨葆组，并且这一效果随鹿血晶浓度降低而减少。但是以上组别的细胞数量均高于对照组。说明鹿血晶具有促进BMSCs增殖的效果，且药物浓度在200μg/mL时效果最佳。

PI3K/AKT信号通路可以保护细胞生存，减少病理损伤因素造成的细胞凋亡[15]。有实验数据表明，在缺血缺氧导致BMSCs凋亡时，细胞内PI3K、AKT蛋白的表达和磷酸化水平下降，其机制可能是PI3K/AKT通过调节BCL-2和Bax等凋亡相关蛋白的表达，实现对BMSCs凋亡的调控[16]。我们使用Western blot检测发现，结果与DAPI实验相同，仙灵骨葆与鹿血晶均提高了PI3K以及AKT的蛋白表达。200μg/mL鹿血晶与仙灵骨葆的效果相当。所以鹿血晶可能通过激活PI3K/AKT信号通路实现对BMSCs的增殖作用。

综上所述，鹿血晶可以通过PI3K/AKT信号通路实现对BMSCs的增殖作用。为今后鹿血晶的实验研究提供新的思路与实验依据。

参考文献:

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