骨质疏松症(osteoporosis, OP)是一类骨量减少、骨微结构破坏，导致骨强度下降、脆性增加的全身性骨病，临床常引发疼痛及骨折风险[1]。绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis, PMOP)是中老年女性骨折的主要危险因素，其发病以雌激素缺乏引发骨重建失衡为主要机制。研究认为免疫状态的变化亦参与了OP的发病机制，绝经后妇女慢性低水平炎症状态可能间接影响骨代谢促进PMOP的发生[2],其中Th17细胞作为辅助性T细胞亚型通过分泌细胞因子IL-17(interleukin-17)影响骨代谢[3,4]。OP抗骨质疏松药物治疗按照不同骨折风险程度推荐分层治疗，目前西医主要治疗药物包括双膦酸盐、地舒单抗、降钙素及雌激素等[5],尽管对OP的机制研究已拓展到免疫学领域，免疫调节制剂能否运用于OP临床治疗还需要更多更深入的研究。然而，中医整体观指导下的辨证论治已将增强机体免疫实践于OP的中医治疗中。

中医认为脾为后天之本，气血生化之源，脾虚水谷失司，则卫气不充，抵御病邪能力下降，“四季脾旺不受邪”,脾气充盛，则外邪不可犯、内疾不能传，与今之免疫学相通[6]。在OP中医病机转化中，脾虚与OP发生发展密切相关。OP中医归为“骨痿”范畴，病机总体以肝肾阴虚、髓枯筋燥，脾肾阳虚、精亏失养，气滞血瘀、脉络瘀阻为主，证型主要分为肝肾阴虚型、脾肾阳虚型及气滞血瘀型三类[7,8],治以补肝益肾、益气健脾、活血化瘀为法。壮骨强肌方是广州中医药大学第三附属医院黄宏兴教授临床经验协定膏方[9],用于治疗OP脾肾阳虚型，功效以补肾健脾、壮骨强肌、活血止痛为长。本研究拟观察壮骨强肌方对去卵巢大鼠骨密度及IL-17的影响，探讨骨与免疫在PMOP疾病中的关系，同时为壮骨强肌方的临床运用补充实验依据。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：

30只SPF级SD大鼠，6月龄，雌性，体重(343±20)g, 由广州中医药大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(粤)2018-0034。饲养条件：恒定温度(23±3)℃,相对湿度(55±5)%,12 h光/12 h暗光照循环，标准营养颗粒饲料，自由饮水饮食。本实验经广州中医药大学实验动物伦理委员会审批通过，伦理审查号：20210922004。

1.1.2 实验药物：

壮骨强肌方组成药物：黄芪30 g、丹参30 g、酒苁蓉30 g、盐杜仲25 g、山药25 g、砂仁30 g、熟地黄25 g及鹿角胶20 g, 实验用浓缩制剂含生药量1 g/mL,由广州中医药大学第三附属医院药剂科代煎；阿仑膦酸钠片剂(国药准字J20130085,批号U06983);戊巴比妥钠(批号922L0314);注射用青霉素钠(国药准字H3702008)。

1.1.3 主要仪器与试剂：

双能X线骨密度仪(美国Hologic, Discovery A型S/N 88761,h Hi-Res),Micro-CT扫描仪(德国SkyScan1276),脱水机(中国武汉俊杰电子有限公司，JJ-12J),包埋机(中国武汉俊杰电子有限公司，JB-P5),病理切片机(中国上海徕卡仪器有限公司，RM2016),正置光学显微镜(日本OLYMPUS,BX53),成像系统(日本尼康，Nikon DS-U3)。IL-17 antibody(Santa Cruz Biotechnology, sc-374218),IL-17A antibody(中国武汉三鹰生物技术有限公司，26163-1-AP),大鼠白细胞介素17(IL-17)ELISA检测试剂盒(江莱生物，JL20879),二甲苯(国药集团化学试剂有限公司，10023418),HE染液(武汉皮诺飞生物科技有限公司),苏木素染液(武汉皮诺飞生物科技有限公司，P0064),中性树胶(国药集团化学试剂有限公司/10004160)。

1.2 方法

1.2.1 造模与评估：

SD大鼠按照随机数字表分为Sham组(假手术组，n=9)和模型组(n=21)。术前禁食禁水12 h, 3%戊巴比妥钠经腹腔注射麻醉(40 mg/kg),麻醉成功后常规脱毛，术区消毒、铺巾。大鼠经背侧部双切口逐层分离皮下组织与肌层，找到卵巢，OVX组予双侧输卵管结扎并卵巢切除，Sham组仅切除卵巢周围等体积脂肪组织，术后各组大鼠腹腔注射青霉素钠(8万/只),连续3 d预防感染。造模12周后，Sham组和OVX组各随机抽取3只大鼠检测腰椎骨密度以验证造模，验证造模大鼠从实验剔除。

1.2.2 分组与给药：

造模成功后，将模型组大鼠按照随机数字表分为OVX组(模型对照组)、ZGQJ组(壮骨强肌方组)和Alen组(阿仑膦酸钠组),每组6只。给药剂量按照临床人与大鼠体表面积换算公式计算(给药量=临床成人每日用药量/60 kg×6.25)。临床壮骨强肌方成人口服10～20 g, 每日1～2次，故将20 g/d作为等效剂量，则ZGQJ组大鼠予以壮骨强肌方2.08 g/(kg·d)灌胃；阿仑膦酸钠成人口服70 mg/周或10 mg/d, 故将10 mg/d作为等效剂量，则Alen组大鼠予以阿仑膦酸钠1.042 g/(kg·d)灌胃；OVX组和Sham组大鼠予以等体积生理盐水灌胃。每周测量1次体重，各组连续给药12周。

1.2.3 样本收集与处理：

各组大鼠称重后3%戊巴比妥钠麻醉，采集腹主动脉血，血样室温静置3 h后离心取上层血清，将血清分装后液氮冷冻保存。取左下肢股骨及胫骨并4%多聚甲醛固定，取右下肢股骨及胫骨液氮冷冻保存，取脾脏称重并4%多聚甲醛固定，以进行下一步检测。

1.2.4 DEXA检测腰椎骨密度：

取材前，各组大鼠麻醉后进行DEXA腰椎部位骨密度检测，大鼠俯卧位。

1.2.5 Micro-CT检测胫骨骨微结构：

固定于4%多聚甲醛的左下肢胫骨用Micro-CT扫描仪扫描，扫描参数设为：电压70 kV,电流200 μA,分辨率10.14 μm, 重建参数最大值0.058及最小值0.000 1。扫描获得的CT数据运用NRecon软件重建三维图像，DataViewer旋转图像，CTvox合成3D图像，CTAn分析骨组织微结构参数，包括骨体积分数(bone volume/tissue volume, BV/TV)、骨小梁数量(trabecular number, Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)及骨小梁分离度(trabecular separation, Tb.Sp)。

1.2.6 HE染色观察股骨骨组织病理变化：

弃4%多聚甲醛，清除软组织，用10% EDTA脱钙液脱钙，每2 d更换新脱钙液，视5 mL注射器针头能刺入骨组织为脱钙完全，继而石蜡包埋，切片。切片烤片处理后依次放入二甲苯、无水乙醇、75%酒精及纯水中以脱蜡；放入苏木素染液、纯水、分化液、纯水、返蓝液及纯水中以苏木素染色；放入梯度酒精及伊红染液以伊红染色；放入无水乙醇、二甲苯以脱水，最后中性树胶封片。各组股骨远端切片用正置光学显微镜选取相同视野拍照，用Image J软件在每个视野中随机框取长宽相同的5个部位描画骨小梁并计算面积(用标尺矫正)。

1.2.7 血清炎症因子IL-17表达水平：

用ELISA法检测血清IL-17表达水平，按试剂盒说明书进行操作。

1.2.8 免疫荧光染色观察胫骨IL-17表达水平：

石蜡包埋切片依次进行脱蜡、微波抗原修复、血清封闭、一抗孵育、二抗孵育及DAYI染核。

1.2.9 HE染色观察脾脏病理变化：

染色步骤同上述骨组织切片HE染色。

1.2.10 免疫组化观察脾脏IL-17表达水平：

石蜡包埋切片依次进行脱蜡、柠檬酸修复液抗原修复、内源性酶阻断、封闭、一抗孵育、二抗孵育及DAB显色，同时进行苏木素复染后封片。

1.3 统计学分析

数据均应用SPSS 22.0统计软件分析处理，本实验数据均为计量资料，其中符合正态分布用均数±标准差表示，不符合正态分布用中位数(四分位数间距)表示[M(P25～P75)]。两样本组间差异比较，符合正态分布用独立样本t检验，否则用Mann-Whitney U检验。多样本组间差异比较，符合正态分布及方差齐性用单因素方差分析(one-way ANOVA),符合正态分布但不满足方差齐性用Welch ANOVA,不符合正态分布则用Kruskal-Wallis非参数检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1 各组大鼠腰椎BMD比较

与Sham组比较，OVX组BMD降低(P<0.05),表明去卵巢骨质疏松模型构建成功。与OVX组比较，ZGQJ组与Alen组BMD增高(P<0.05)。与ZGQJ组比较，Alen组BMD较高(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠腰椎骨密度比较(g/cm2)

2.2 各组大鼠胫骨骨微结构

大鼠胫骨近端Micro-CT三维重建可见，对比Sham组，OVX组骨小梁数量减少，小梁间间隙增大，而ZGQJ组与Alen组明显改善上述现象。定量分析验证对比Sham组，OVX组BV/TV及Tb.N降低(P<0.05),Tb.Sp增高(P<0.05);对比OVX组，ZGQJ组与Alen组BV/TV、Tb.N及Tb.Th增高(P<0.05),Tb.Sp降低(P<0.05);ZGQJ组与Alen组相比，Alen组BV/TV及Tb.N更高(P<0.05),Tb.Sp更低(P<0.05)。见图1。

图1 Micro-CT检测胫骨骨微结构   

2.3 各组大鼠股骨HE染色

与Sham组比较，OVX组大鼠股骨骨小梁形态变细，网状结构破坏，骨髓腔内脂肪空泡增多，骨小梁面积减少(P<0.05)。与OVX组比较，ZGQJ组与Alen组骨小梁增粗，网状结构明显，骨小梁面积增多(P<0.05),ZGQJ组骨髓腔内脂肪空泡明显改善。与ZGQJ组比较，Alen组骨小梁面积较高(P<0.05)。见图2。

2.4 各组大鼠血清IL-17表达水平

与Sham组比较，OVX组大鼠血清IL-17表达增高(P<0.05)。与OVX组比较，ZGQJ组与Alen组血清IL-17水平较低(P<0.05)。ZGQJ组与Alen组对比无差别(P>0.05)。见图3。

2.5 各组大鼠胫骨IL-17免疫荧光染色

免疫荧光染色可见各组大鼠胫骨髓腔内组织细胞胞质均有不同程度IL-17表达。与Sham组比较，OVX组大鼠胫骨IL-17表达增高(P<0.05)。与OVX组比较，ZGQJ组大鼠胫骨IL-17表达降低(P<0.05),Alen组对比无差别(P>0.05)。ZGQJ组大鼠胫骨IL-17表达较Alen组低(P<0.05)。见图4。

图2 各组大鼠股骨HE染色   

图3 各组大鼠血清IL-17表达水平比较  

2.6 各组大鼠脾脏组织病理及脾脏指数

Sham组大鼠脾脏红髓与白髓交界明显，脾小体结构清晰，淋巴小结与动脉周围淋巴鞘深浅分明，大抵呈圆形。与Sham组比较，OVX组与Alen组大鼠脾脏红髓与白髓交界不清，脾小体形态不规则，呈条索状。与OVX组比较，ZGQJ组大鼠脾脏脾小体形态规则，交界明显，在病理结构上明显改善。

与Sham组比较，OVX组大鼠脾脏指数下降(P<0.05)。与OVX组比较，ZGQJ组大鼠脾脏指数提高(P<0.05)。ZGQJ组与Alen组无差别(P>0.05)。见图5。

图4 各组大鼠胫骨IL-17免疫荧光染色   

图5 各组大鼠脾脏组织HE染色   

2.7 各组大鼠脾脏IL-17表达水平

各组大鼠脾脏均有不同程度IL-17表达。在Sham组呈淡黄色低表达，与Sham组相比，OVX组呈棕褐色高表达(P<0.05)。与OVX组比较，ZGQJ组呈黄棕色低表达(P<0.05),Alen组对比无差别(P>0.05)。ZGQJ组大鼠脾脏IL-17表达较Alen组低(P<0.05)。见图6。

图6 各组大鼠脾脏组织IL-17免疫组化染色  

3、讨论

肾为先天之本，主骨，生髓，促进人体生长发育及生殖功能。《圣济总录》中言：“骨属于肾，肾若虚损，则髓竭骨枯”,说明肾虚是OP发生发展的根本。《素问·上古天真论》中言：“女子四七筋骨坚……七七任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭”,肾气充盛则筋骨强健，随着年龄增长肾气渐趋衰竭至天癸竭，女性绝经后精亏骨髓失养引发PMOP。脾作为后天之本，与OP的发生发展亦密切相关[10,11]。《脾胃论》中言：“脾胃虚弱……五脏之气不生。脾病则下流乘肾，土克水，则骨乏无力，是为骨蚀，令人骨髓空虚”,脾主运化以生气血，脾气充盛则水谷精微运化有所主，气血生化有源则五脏得以濡养，肾精得以滋养则骨强，脾气虚弱则运化失司，气血生化乏源则五脏失养，肾精失充则骨枯。《伤寒论·平脉法》中言：“寸口脉缓而迟，缓则阳气长……迟则阴气盛，骨髓生”,胃合卫气，卫气调和充盛于外则寸口脉缓，脾合营气，营充血满于内则脉迟，脾胃强健，营卫调和，阴阳相济，则骨髓生长。“女子五七，阳明脉衰，面始焦，发始堕”也能说明脾胃虚弱肾精失充在PMOP发生发展中的重要作用。因此OP的治疗不能只着眼于补肾填精，补肾与健脾并重才是根本。本研究之壮骨强肌方以补肾健脾、壮骨强肌、活血止痛为长，研究结果显示与OVX组比较，ZGQJ组腰椎BMD增高(P<0.05),胫骨BV/TV、Tb.N及Tb.Th增高(P<0.05)且Tb.Sp降低(P<0.05),股骨HE染色骨小梁面积增多(P<0.05)且髓腔内脂肪空泡改善，表明壮骨强肌方具有增强去卵巢大鼠腰椎骨密度、改善胫骨及股骨骨小梁结构的作用。

雌激素下降和骨骼对机械刺激产生的适应性反应减弱是PMOP骨丢失的主要机制[12],随着对PMOP发病机制的深入研究，许多研究表明免疫系统与骨骼系统之间存在复杂的联系，免疫细胞通过分泌各种炎性介质直接或间接的调节骨细胞、成骨细胞及破骨细胞的活动，反之，不同类型的骨细胞亦能影响免疫细胞的活性[13,14,15],如巨噬细胞的促炎表型M1型可促进高活性氧环境的形成和破骨细胞因子TNF-a和IL-1β的释放以促进破骨细胞的发生，而抗炎表型M2型分泌TGF-β和IL-10等抗炎细胞因子发挥抗炎和免疫调节作用[16,17,18],雌激素缺乏可使M1型极化增强而M2型极化受损[19],PMOP患者中存在TNF-α和IL-1β因子水平增加的表型[2];树突状细胞可表达RANKL,产生促炎细胞因子TNF-α和IL-1等以促进形成[20],还可以直接分化为破骨细胞[21];中性粒细胞的过度活跃利于破骨细胞骨吸收，而雌激素可抑制中性粒细胞过度活化[22];活化的T细胞通过在PMOP中强表达RANKL促进破骨细胞的发生[23];B细胞可产生RANKL以刺激破骨细胞的形成[24]。然而对免疫器官与骨代谢的研究较少，因此，本研究通过去卵巢大鼠脾脏HE染色观察雌激素缺乏对最大的免疫器官脾的影响，研究结果显示与Sham组比较，OVX组大鼠脾脏组织出现红髓与白髓交界不清、脾小体形态不规则病理改变，脾脏指数下降(P<0.05)。在诸多免疫细胞中，CD4+ T辅助(Th)细胞在骨重塑的调节中发挥了关键作用，根据细胞因子表达谱的不同分为Th1、Th2、Th17和Treg细胞亚群。Th1细胞可通过产生TNF-α促进破骨，还可通过产生IFN-γ抑制破骨，具有双重作用；Th2细胞通过产生Il -4、IL-5和IL-13发挥抗炎及保护骨骼的作用；Treg细胞通过减少破骨细胞数量发挥骨保护作用[25,26]。Th17细胞作为辅助性T细胞亚型中促破骨细胞亚型，其在骨重塑过程中的作用主要通过其分泌的特征性促炎因子IL-17产生。主流的观点认为IL-17通过上调破骨细胞前体上的RANK受体表达从而促进破骨细胞分化[27],阻断IL-17通路对OVX小鼠骨丢失具有保护作用[28],条件性敲除破骨前体的IL-17A受体表现骨保护作用且破骨细胞形成减少[3],雌激素缺乏时Th17/Treg平衡被破坏[25],Th17细胞本身也可通过表达RANKL直接激活破骨细胞前体[29,30,31]。因此，本研究通过检测去卵巢大鼠血清、胫骨及脾脏IL-17表达水平，验证雌激素缺乏对IL-17表达的影响，研究结果显示与Sham组比较，OVX组大鼠血清、胫骨及脾脏IL-17表达增高(P<0.05),与既往研究结果一致。

中医认为脾为后天之本，气血生化之源，《景岳全书》中言：“五脏中皆有脾气”,脾气充盛，水谷精微经脾输布全身，五脏得以濡养而各司其职，卫气得以充养而抵御外邪有力，外邪不可犯、内疾不能传则身体强健，与今之免疫学相通。因此，本研究通过中药灌胃后去卵巢大鼠血清、胫骨及脾脏IL-17表达水平检测，观察壮骨强肌方对去卵巢大鼠IL-17免疫的影响，研究结果显示与OVX组比较，ZGQJ组大鼠血清、胫骨及脾脏IL-17表达降低(P<0.05)。同时，ZGQJ组大鼠脾脏组织病理结构明显改善，脾脏指数提高(P<0.05),表明壮骨强肌方具有调节去卵巢大鼠IL-17表达及改善脾脏免疫功能作用。

综上所述，去卵巢大鼠存在骨密度降低及骨小梁微结构破坏等骨重建失衡改变的同时，免疫系统也受到不同程度影响。中药壮骨强肌方具有提高去卵巢大鼠腰椎骨密度，改善胫骨及股骨骨小梁结构，降低IL-17表达，改善脾脏免疫功能作用，为其临床运用提供了一定科学依据。

参考文献:

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[8]闫晓娜,高毅,王舒,等.原发性骨质疏松症中医证型分布及其相关研究概述[J].山东中医药大学学报,2023,47(5):680-683,688.

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[10]徐芳园,张文超,赵峥嵘,等.“脾肾为本､血瘀为标”论绝经后骨质疏松症的病机及防治[J].中国骨质疏松杂志,2022,28(12):1833-1837.

[11]华臻,彭竑程,尹玉宝,等.中医药从脾论治骨质疏松症[J].中国骨质疏松杂志,2022,28(8):1223-1227,1243.

基金资助:国家自然科学基金(82274551);广州中医药大学“双一流”与高水平大学学科协同创新团队重点项目(2021XK21);

文章来源:东智卓玛,杨彬彬,林适等.壮骨强肌方对去势大鼠骨密度及IL-17的影响[J].中国骨质疏松杂志,2024,30(01):62-69.