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天麻素对血管性痴呆小鼠抑郁症状的影响

2024-05-11 126 上传者：管理员

摘要：目的研究天麻素对血管性痴呆(VD)小鼠抑郁症状的影响及可能机制。方法将小鼠随机分为假手术组、模型组、天麻素低、中、高剂量(50、100、200 mg/kg)组。采用双侧颈总动脉缺血再灌注法构建VD小鼠模型。通过强迫游泳(FST)、悬尾实验(TST)测试天麻素对VD小鼠的抑郁症状的影响；采用Western印迹法检测海马组织神经元核抗原(NeuN)、突触素(SYP)和突触后致密蛋白(PSD)-95的蛋白表达变化。结果与假手术组相比，模型组FST、TST不动时间显著增加(P<0.01)。与模型组相比，天麻素低、中、高剂量组TST的不动时间显著减少，天麻素中、高剂量组FST的不动时间显著减少(P<0.05)。Western印迹结果显示，与假手术组相比，模型组NeuN、SYP、PSD-95表达量均显著减少(P<0.01);与模型组相比，天麻素组NeuN、SYP、PSD-95表达量显著增加(P<0.05)。结论天麻素对VD小鼠抑郁症状具有改善作用，其机制可能与抑制神经元的丢失及改善突触可塑性有关。

关键词：
天麻素
神经元核抗原
突触后致密蛋白95
突触素
血管性痴呆
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血管性痴呆(VD)主要是指脑血管损害而引起的一种痴呆，是老年痴呆的常见类型之一[1]。而抑郁作为VD所引发的最为常见的一种情绪障碍，不仅严重影响患者的身心健康，还会不同程度地损害患者神经功能，降低其生命质量。临床报告显示，许多抑郁患者有不同程度的症状表现，如快感缺乏、意志活动减退、思维迟缓等[2,3]。天麻素是中草药天麻的主要成分，作用于中枢神经系统，具有镇静、抗惊厥等药理作用[4],临床可改善各种情感性精神障碍症状[5]。前额叶皮层、海马和纹状体是众所周知的抑郁症靶脑区[3]。有研究发现，可以通过减轻甲状腺功能减退症状大鼠海马区神经元损伤进而改善抑郁症状[6]。突触作为神经元的特有结构之一，突触的数量和形态是体现中枢神经系统功能变化的重要指标之一。研究表明，在抑郁症状的形成过程中，神经突触可塑性的改变起到了至关重要的作用，在抑郁状态下，常伴随着突触可塑性损伤和神经元凋亡等病理改变，其中，海马是主要的靶部位[7]。因此，本文通过强迫游泳实验(FST)、悬尾实验(TST)等行为学实验测试天麻素对VD小鼠抑郁症状的影响，并检测海马组织神经元核抗原(NeuN)和突触素(SYP)、突触后致密蛋白(PSD)-95的表达水平，从神经元及突触可塑性角度探讨天麻素对VD小鼠抑郁症状的可能作用机制。

1、材料与方法

1.1 实验动物

昆明小鼠60只，雌雄各半，体质量18～22 g, 购自辽宁长生生物技术股份有限公司，动物生产许可证号为SCXK(辽)2020-0001,动物使用许可证号为SYXK(黑)2021-013。伦理批件批号为QMU-AECC-2021-2035。

1.2 试剂

天麻素注射液购自海南倍特药业有限公司，抗SYP抗体、抗PSD-95抗体、抗NeuN抗体均购自Proteintech公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒和一抗、二抗去除液购自碧云天生物技术研究所；二抗购自北京中杉金桥生物技术公司。

1.3 双侧颈总动脉夹闭(BCCAO)动物模型的建立

实验开始1 w前，小鼠进行适应性喂养，温度(24±2)℃,湿度(54±10)%。小鼠仰卧位固定于鼠板，腹腔注射0.3%戊巴比妥钠进行麻醉，充分暴露颈部皮肤并进行常规消毒，在颈部腹侧切开以暴露颈总动脉，钝性分离双侧颈总动脉，除假手术组外，每组小鼠均进行颈总动脉夹闭30 min, 造成脑缺血再灌注损伤，假手术组仅分离迷走神经和颈总动脉，但不结扎颈总动脉。

1.4 动物分组及给药方法

将造模成功的小鼠随机分为模型组、天麻素低、中、高剂量(50、100、200 mg/kg)组。小鼠在颈总动脉夹闭30 min后再灌注后，腹腔注射天麻素，假手术组和模型组腹腔注射等容量生理盐水，每日1次，连续给药14 d。

1.5 FST[8]

将小鼠单独放置在一个透明的玻璃缸(直径25 cm)中，玻璃缸内注入30cm深的水(保持在25 ℃)。每只小鼠适应2 min, 然后记录4 min内的不动时间。不动标准：小鼠在水面漂浮，仅有头部露出水面，通过前肢及尾部轻微摆动以维持身体平衡。小鼠不动时间反映其抑郁程度。

1.6 TST[8]

将小鼠用胶带在尾部2cm处倒置固定于悬尾杆上，小鼠身体置于20 cm×20 cm×30 cm的自制悬尾箱中，头部离悬尾箱底30 cm。倒挂适应2 min后记录4 min内累计不动时间。不动标准：小鼠倒挂静止不动放弃挣扎。小鼠在此实验中静止不动时间与其抑郁程度呈正比关系。

1.7 Western印迹检测相关蛋白表达

小鼠断头取脑，生理盐水冲洗表面血迹，冰上快速分离海马组织，液氮迅速冷冻，-80 ℃冻存，备用。提取假手术组、模型组和高剂量天麻素组(行为学治疗效果最为显著)的海马蛋白，采用BCA蛋白定量浓度测定试剂盒对样品蛋白进行定量。100 ℃煮沸5 min, 将样品进行分装，于-20 ℃储存。配制Western印迹相关试剂，采用10%聚丙烯酰胺分离胶，4%聚丙烯酰胺浓缩胶进行电泳后转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h, 加一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，加二抗，室温孵育2 h, 洗3次，滴加电化学发光(ECL)液，显影，定影。以β-actin为内参，检测各条带的灰度值，计算NeuN、SYP、PSD-95等蛋白的相对表达量。

1.8 统计学分析

采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)、LSD-t检验。

2、结果

2.1 天麻素对VD小鼠TST的影响

与假手术组相比，模型组TST不动时间显著增加(P<0.01);与模型组相比，天麻素低、中、高剂量组TST不动时间显著减少(P<0.05),高剂量组作用最显著(P<0.01),见表1。

2.2 天麻素对VD小鼠FST实验的影响

与假手术组相比，模型组FST不动时间显著增加(P<0.01);与模型组相比，天麻素中、高剂量组FST不动时间显著减少(P<0.05),表明天麻素可以改善VD小鼠抑郁样行为，高剂量组作用最显著(P<0.01),见表1。

表1 天麻素对VD小鼠TST、FST的影响

2.3 天麻素对VD小鼠海马组织中NeuN蛋白表达水平的影响

与假手术组相比，模型组NeuN表达量均显著减少(P<0.01);与模型组相比，天麻素组海马内NeuN表达量显著增加(P<0.05),提示天麻素能显著减少海马神经元的丢失，见图1、表2。

2.4 天麻素对VD小鼠海马组织中SYP、PSD-95蛋白表达水平的影响

与假手术组相比，模型组SYP、PSD-95表达量均显著减少(P<0.01);与模型组相比，天麻素组海马内SYP、PSD-95表达量显著增加(P<0.05),提示天麻素能显著增加海马突触相关蛋白SYP、PSD-95的蛋白表达，从而对VD小鼠抑郁症状可能具有改善作用，见图1、表2。

图1 Western印迹检测各组NeuN、SYP、PSD-95蛋白表达

表2 天麻素对海马NeuN、SYP、PSD-95表达的影响

3、讨论

研究显示，天麻素通过扩张脑血管、抗细胞凋亡、抗氧化、抗炎、抑制自噬等而发挥神经保护作用[9]。目前通过缺血动物模型研究发现，采用BCCAO导致全脑缺血再灌注可以较好地再现临床脑缺血损伤[10]。本实验结果提示，天麻素对于VD小鼠伴发抑郁症状具有良好的改善作用。同时，天麻素在长期治疗神经系统疾病的临床应用中，其安全性已得到充分证实。本研究结果提示，天麻素可能在治疗VD抑郁症状方面具有良好的前景。

脑缺血会导致神经元凋亡或坏死。有研究指出，神经元凋亡诱导的海马损伤可能是诱发抑郁患者器质性病变的基础之一[11],基础与临床研究也揭示了抑郁与海马等大脑不同区域之间的相关性[12]。临床研究显示，抑郁患者海马体积有一定程度的减少及萎缩[13]。神经元核抗原NeuN特异性地与神经元细胞核的抗原结合，是中枢神经系统神经元成熟的标志物，在正常脑组织的椎体神经元和颗粒性神经元中表达。本文结果提示，天麻素对VD小鼠抑郁症状的改善作用机制可能是通过减少神经元丢失，改善抑郁症状。

突触可塑性是大脑接受外部刺激，并通过调节突触的强度形成网络功能的基本能力[14]。抑郁发病与突触减少密切相关，突触可塑性发生异常变化[15]。研究发现，抑郁小鼠海马神经可塑性受损，而神经可塑性主要表现在突触可塑性，为研究抑郁症的主要目标[15]。慢性应激抑郁模型中，小鼠的突触可塑性的调节功能出现异常[14]。PSD-95、SYP均为突触蛋白标志物。PSD-95是突触后膜含量最丰富、最重要的脚手架蛋白，主要存在于谷氨酸突触的突触后密度区，为突触后膜受体稳定性和活动性所必需，在突触可塑性和稳定性等方面中起重要作用[16]。它能调节神经元及突触可塑性，且对神经递质及其他神经营养因子的合成有重要影响[17]。SYP是一种与突触功能密切相关的膜蛋白，存在于突触前囊泡上，它被认为是突触前末梢的特异性标记蛋白，其表达反映突触密度、分布面积和功能状态，从而反映可塑性[18]。SYP表达变化受中枢神经系统结构和功能的影响，当机体处于抑郁状态，神经元突触数量减少，突触可塑性降低[19]。本文结果提示，天麻素可能是通过调节VD小鼠突触相关蛋白表达，影响突触可塑性，进而改善VD小鼠抑郁症状。

综上，VD可引起小鼠抑郁症状，天麻素可减轻VD小鼠的抑郁症状，上调SYP、PSD-95及NeuN蛋白的表达，减少神经元的丢失，增强突触可塑性，从而改善VD所引起抑郁症状。但是天麻素改善VD抑郁症状中的作用机制尚需进行几个方面研究：(1)进行其他行为学实验(如新奇抑制摄食实验、三箱实验、糖水偏好实验等)进一步验证天麻素改善VD小鼠抑郁行为的作用。(2)进行尼氏染色、电镜等实验观察天麻素对VD小鼠海马神经元形态的影响。(3)采用Western印迹法检测天麻素对凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax等)表达的影响，考察天麻素对VD小鼠神经元凋亡的作用。

参考文献:

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