在过去的数十年中，免疫疗法获得飞速发展，在传染性疾病与晚期恶性肿瘤的治疗中取得巨大突破。在这些疗法中，免疫检查点抑制剂(immunecheckpointinhibitors,ICIs)疗法被认作是最有前途也是当前研究最为深入的疗法之一[1,2]。目前，基于细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)与程序性死亡受体1(PD-1)/程序性死亡配体1(PD-L1)靶点的抑制剂已实现由实验室到较大规模临床应用的转变。然而，在应用过程中却暴露出一系列问题:部分患者虽有PD-1/PD-L1和/或CTLA-4的阳性表达，却对药物无应答，更有甚者，出现病情超进展(hyperprogressivedisease,HPD)，病情迅速恶化;越来越多早期对治疗有反应的患者最终结局为病情进展，表现为原发性或继发性耐药;患者总体的应答率与设想存在较大差距，治疗结果尚不能令人满意[3,4,5]。研究[6]发现，治疗过程额外的检查点分子上调是产生低应答率与耐药性的重要机制之一。因此，寻找额外的免疫检查点克服当前存在的问题引发学界关注。据报道，目前已发现多种新型靶点，如淋巴细胞活化基因-3(lymphocyte-activationgene3,LAG-3)[7]、淋巴细胞衰减子[8]以及唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素15[9]等。其中LAG-3作为潜在靶点在机体免疫中发挥了重要作用而引发广泛关注[7]。肝脏是机体重要的消化器官，其独特的免疫环境及血流供应成为病毒、肿瘤、自身抗体以及寄生虫主要侵犯的靶器官，相关疾病严重威胁患者生命健康安全。因此探索LAG-3在肝脏相关疾病中的作用成为当下研究热点。目前关于LAG-3参与肝脏相关疾病的发生发展缺乏系统认识，本文就LAG-3在肝脏相关疾病中的研究进展进行综述。

1、生物学特性

1.1LAG-3的结构

LAG-3，又称CD223，最早由Triebel等[10]发现，是免疫球蛋白超家族成员的一种膜蛋白。分子量为70kD，定位于人12号染色体短臂末端(12p13.3)。在发现之初也将LAG-3定义为CD4样(CD4-like)的膜蛋白[11,12]。LAG-3编码基因包含8个外显子，其对应的cDNA编码一类含有498个氨基酸的Ⅰ型穿膜蛋白，该膜蛋白由胞外区、穿膜区和胞内区三部分组成。胞外区由4个免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域D1、D2、D3和D4组成。D1属于V系免疫球蛋白超家族，而D2、D3和D4属于C2系免疫球蛋白超家族。其中D1与D3、D2与D4之间具有高度同源性，推断可能是由2个IgSF区域基因复制而成的4个区域。在D1区有一个由30个氨基酸组成的具有特异性的环状结构，还含有一个异常的链内“二硫桥”。LAG-3的胞质区由3个特殊的蛋白质基序组成，分别是:保守的KIEELE基序;丝氨酸磷酸化位点S454;重复的谷氨酸-脯氨酸序列。其中KIEELE基序是在其他蛋白质中均未出现过的高度保守序列，参与LAG-3分子胞内信号转导，缺少此段基序将不能对T淋巴细胞产生抑制作用[13,14]。在跨膜基质金属蛋白酶类AMAD10/17的介导下，成熟的LAG-3分子可将D4跨膜结构域中的一段连接肽在细胞膜上断裂为相对分子质量为54kD可溶性部分(p54)以及16kD的肽段(p16)，从而维持细胞膜上LAG-3表达的相对平衡[15,16]。

1.2LAG-3的表达及配体

LAG-3在人体表达局限于有炎症的扁桃体、淋巴结或滤泡状增生组织单个核细胞的亚群中[15,16]。最近研究[17,18,19]发现，在多种实体瘤的肿瘤浸润淋巴细胞中，LAG-3也呈现高表达。LAG-3作为表达在淋巴细胞表面一种抑制分子，在维持内环境稳定方面起特定作用。主要组织相容性复合体-Ⅱ(MHC-Ⅱ)是第一个被发现也是比较受认可的LAG-3配体，靶向抑制MHC-Ⅱ有助于T淋巴细胞激活。但其是否单独负责LAG-3的免疫抑制功能存在较大争议。目前已发现LAG-3的多种替代配体，如半乳糖凝集素-3，肝窦内皮细胞凝集素和α-突触核蛋白纤维，可以解释LAG-3无需MHC-Ⅱ的参与而对各种类型的淋巴细胞起到抑制作用。在最近研究中，Wang等[20]发现并证实纤维蛋白原样蛋白1(FGL1)是LAG-3发挥T淋巴细胞抑制功能的主要配体，进而提出了新的肿瘤免疫逃逸通路FGL1-LAG-3，对发展下一代肿瘤免疫疗法具有重要意义。

1.3LAG-3的抑制机制

LAG-3的胞质区缺乏典型的抑制基序。抑制信号可能通过胞质区特殊的蛋白质基序(如FsaL基序)进行转导。Maeda等[21]认为，LAG-3的抑制功能与其在细胞表面的表达水平密切相关，氨基酸的取代和缺失会实质性影响LAG-3的表达水平。Workman等[22]发现KIEELE基序的赖氨酸残基在介导LAG-3发挥抑制作用中起关键作用，但其机制有待进一步研究。研究表明FsaL基序中的苯丙氨酸和亮氨酸被丙氨酸取代会显著降低LAG-3的抑制能力。此外，当同时存在FsaL序列发生突变与重复的谷氨酸-脯氨酸基序缺失时，LAG-3的抑制能力完全丧失。但仅谷氨酸-脯氨酸重复基序的缺失并不影响LAG-3的抑制能力。说明LAG-3可能转导FsaL基序和谷氨酸-脯氨酸重复基序两个独立的抑制信号，但传导信号的分子机制仍然未知[21]。

2、LAG-3与肝脏相关疾病

2.1LAG-3与乙型肝炎

免疫检查点疗法应用于慢性病毒感染性疾病已成为当下研究的热点。LAG-3作为潜在的靶点引起研究者关注。Ye等[23]通过检测80例慢性乙型肝炎(CHB)患者、10例慢性无症状HBV携带者(ASCs)以及18例正常健康人(HCs)外周血中CD8+T淋巴细胞表达的LAG-3发现，CHB组显著高于ASCs组与HCs组。作为反映CD8+T淋巴细胞功能的标志物IFNγ在CHB组分泌显著降低。给予阻断剂后可部分恢复受损CD8+T淋巴细胞功能，与单独使用PD-L1抗体相比，联合使用LAG-3和PD-L1抗体可更有效的恢复其功能。在HBV的感染和清除期间，CD4+T淋巴细胞在调节CD8+T淋巴细胞参与免疫应答的过程中起关键作用。Dong等[24]对比了CHB组与HCs组外周血中CD4+T淋巴细胞LAG-3的分布情况，发现CHB组中LAG-3出现显著升高。与此同时，高表达LAG-3的CD4+T淋巴细胞分泌的IFNγ、IL-2和TNFα明显减少，阻断LAG-3后，CD4+T淋巴细胞功能部分恢复。除此之外，LAG-3还可以影响调节性T淋巴细胞(Treg)的表达，介导其分泌抑制性细胞因子抑制CD4+和CD8+T淋巴细胞的激活和增殖。研究[23]发现，PD-1和LAG-3的表达与HBVDNA滴度无明显关系，与血清ALT水平呈正相关，提示与肝损伤程度相关。目前对慢性HBV的治疗尚停留在抗病毒治疗的阶段。由于肝细胞核内cccDNA存在，绝大多数患者需终生服药，不能达到彻底治愈。联合应用抗体阻断LAG-3与PD-1介导的T淋巴细胞免疫耐受状态，从而促进特异性免疫应答的恢复，将成为治疗慢性HBV感染新策略。

2.2LAG-3与丙型肝炎

HCV起病隐匿且病情进展缓慢，目前尚无有效的疫苗可供使用。肝硬化和HCC是慢性HCV感染者的主要死因[25]。研究发现，在慢性HCV感染过程中，肝组织及外周血中HCV特异性CD8+与CD4+T淋巴细胞均高表达LAG-3，表现出功能性耗竭[26,27]。但也有研究[28]发现，无论是HCV抗体阳性还是阴性的患者，肝内和外周CD8+T淋巴细胞中LAG-3的表达没有显著差异。由于相关研究均未将病毒载量的数据纳入，研究结果差异的原因有待进一步探讨[28]。此外研究[29,30]发现，LAG-3还可通过调节Treg细胞与1型调节性T淋巴细胞功能致使HCV持续感染及复发。最近研究表明，LAG-3还参与HCV体液免疫调节。HCV感染过程中LAG-3+CD4+T淋巴细胞增多并表现出Treg样表型。LAG-3+CD4+T淋巴细胞的频率与CXCR3+循环滤泡性辅助性T淋巴细胞负相关。在HCV感染期间，LAG-3可能充当负向调节剂，参与中和抗体反应的调节，在介导体液免疫调节中起重要作用。这与阻断PD-1和LAG-3显著增强小鼠恶性疟原虫感染期间抗体反应的报道[18]相一致。但是LAG-3+CD4+T淋巴细胞是否作为Treg调节循环滤泡性辅助性T淋巴细胞应答仍有待确定[31]。这一发现将有助于进一步了解HCV的持续性感染机制，并通过这些免疫紊乱现象改善疫苗接种方案，达到病毒根治的目的。

2.3LAG-3与肝细胞癌(HCC)

近年来以PD-1、CTLA-4免疫检查点为靶点的新型药物已成为治疗晚期HCC的二线药物[32]。在我国，70%～90%的HCC与HBV感染有关，HBV抗原被认为是HCC的肿瘤相关抗原[33]。Wang等[34]对比了CHB与HCC患者CD8+T淋巴细胞表型与功能状态，发现HCC组织中CD8+T淋巴细胞表达的LAG-3、PD-1等耗竭标志物水平更高，细胞增殖水平与活性也明显低于CHB。分析发现两者在表型、功能状态和潜在机制有所不同，推测可能是由不同的途径驱动，其机制不明有待进一步研究。Guo等[35]检测了143例HCC患者肿瘤组织及肿瘤旁正常组织中LAG-3、FGL1、PD-L1与CD8+T淋巴细胞分布及表达情况，发现肿瘤组织中LAG-3和FGL1的表达水平明显高于正常组织，而PD-L1和CD8低于邻近正常肝组织。高水平的FGL1与高密度的LAG-3+细胞密切相关，与PD-L1无关。CD8+T淋巴细胞密度与PD-L1水平呈正相关，与FGL1表达呈负相关。高水平的LAG-3+细胞往往代表患者预后不佳。研究者通过体外分离并扩增单纯HCC患者与HCC合并尿毒症患者外周血中CD8+T淋巴细胞发现后者LAG-3+CD8+、PD-1+CD8+T淋巴细胞等肿瘤反应性细胞比例明显低于前者，说明HCC合并尿毒症患者的抗肿瘤能力低于单纯HCC患者，HCC合并尿毒症患者外周血单个核细胞中获得的肿瘤反应性细胞不适用于T淋巴细胞治疗[36]。研究表明，LAG-3与PD-1/PD-L1具有协同作用。HCC组织中绝大多数PD-1染色阳性的肿瘤浸润淋巴细胞LAG-3表达也增加，但也有研究发现少部分病例只有LAG-3单个靶点表达上调，推测部分HCC患者可能受益于LAG-3通路的抑制，而非PD-1通路，LAG-3免疫检查点会限制单药阻断HCC靶点的功效[35]。针对LAG-3在HCC治疗中的应用已引起关注。Wang等[37]发现氧化槐果碱可通过下调IL-6介导的JAK2/STAT3信号转导途径降低FGL1的表达进而增敏LAG-3拮抗剂介导的体内外CD8+T淋巴细胞抗HCC细胞(Hepa1-6和HepG2)的作用，为联合使用LAG-3拮抗剂治疗HCC提供了潜在证据。最近研究[38]发现，双特异性抗体MGD013和FS118可与小鼠肿瘤模型中的LAG-3和PD-L1同时结合，阻断其介导的免疫抑制进而增强机体抗肿瘤能力，此发现为下一代检查点抑制剂的研制提供新的方向。LAG-3为HCC的免疫治疗提供了新思路，对于PD-1/PD-L1抗体产生耐药的患者将于LAG-3抗体或LAG-3抗体与PD-1/PD-L1抗体的联合应用中获益。

2.4LAG-3与自身免疫性肝病(ALD)

ALD是一类由自身免疫介导的肝损伤，与基因易感性、异常的免疫调节网络以及分子模拟有关。目前尚未明确自身免疫环境发生异常的机制，初步考虑与自身免疫耐受的机制被破坏有关。传统观点认为体内免疫环境的稳态及自身免疫性反应的发生与Treg的数量及功能有密切关系[39]。研究者通过检测ALD患者体内Treg细胞发现其表达的LAG-3与TIM-3数量较正常人明显减少，同时介导Treg数量减少，限制其发挥免疫调节作用[40,41]。目前证据表明，LAG-3在自身性免疫性疾病的发生发展中起重要作用。研究[42]发现，LAG-3或PD-1单个检查点缺失的小鼠会出现自身免疫反应，但程度相对较轻。而同时敲除LAG-3与PD-1的小鼠却表现出较为严重的全身性自身免疫反应，说明抑制性免疫检查点丢失或抑制会促进自身免疫性疾病的发生与发展。据报道[43]，部分接受ICIs疗法的晚期肿瘤患者也会出现自身免疫性反应，也从侧面验证了上述结论。此外研究发现，ALD患者外周血中T淋巴细胞表达的LAG-3[44]与PD-1[45]代偿性升高，推测与肝组织炎症活动相关，但其引发的免疫下调作用远不能抗衡疾病的发生发展，是抑制性信号“相对缺失”的表现。目前，针对ALD的治疗尚处在初期阶段，激素联合免疫抑制剂仍是首选的治疗方案，但严重的副反应限制了患者的受益时间，亟待新型药物的研发。基于LAG-3、PD-1、TIM-3等靶点的激动剂单独或联合应用有望恢复机体免疫耐受状态，抑制自身免疫反应，达到控制ALD病情进展的目的。

2.5LAG-3与非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)

NAFLD作为一种多系统受累的代谢性疾病，与代谢综合征以及2型糖尿病互为因果，共同促进肝硬化、HCC以及结直肠肿瘤等肝外脏器肿瘤的发生。非酒精性脂肪性肝炎(NASH)作为NAFLD疾病谱中重要的疾病，因其致病机制复杂且具有高度向肝纤维化与HCC转变的风险已成为肝移植的主要原因之一[46]。NASH是目前少数没有任何标准疗法的常见病之一。研究[47]发现，患有NASH的小鼠疾病进展过程中常伴随内源性IgA+细胞的积聚，IgA+细胞表达的PD-L1可直接与CD8+T淋巴细胞上相关受体结合抑制其功能进而加速向HCC的发展，给予PD-L1阻断剂后CD8+T淋巴细胞被激活进而诱导HCC消退。同期试验中研究者注意到，先天性缺乏CD8+T淋巴细胞的NASH小鼠出现肿瘤生长，缺乏IgA+细胞但保留CD8+T淋巴细胞NASH小鼠几乎均未出现肿瘤生长。研究[47]认为，NAFLD等慢性肝炎可通过抑制体内CD8+T淋巴细胞功能进而加速向HCC转变。已有多项试验发现，慢性肝炎疾病中LAG-3表达水平明显升高，抑制了CD8+T淋巴细胞的功能，这可能是慢性肝炎进展为HCC的重要原因。目前相关研究相对较少，有理由相信基于LAG-3的检查点抑制剂可延缓NASH向HCC的病程进展，有望成为NASH治疗中的新策略。

2.6LAG-3与肝多房棘球蚴病(hepaticalveolarechinococco-sis,HAE)

棘球蚴病根据感染棘球绦虫的种类不同可分为细粒棘球蚴病(cysticechinococcosis,CE)与多房棘球蚴病(alveolarechinococcosis,AE)。其中AE的致病性、致残率和致死率均高于CE，又因其感染人体后的生物学行为与恶性肿瘤类似，故有“虫癌”之称[48]。依赖于多种免疫逃避机制，多房棘球绦虫可在宿主体内长期生存。患者早期多无明显临床症状，多数就诊时已进入病程晚期，失去手术机会。研究[49]发现，HAE患者外周血清中LAG-3、PD-1、TIM-3及其他免疫耗竭标志物较正常人明显增高，病灶旁肝组织的表达水平显著高于远处正常肝组织，提示T淋巴细胞耗竭。Bellanger等[50]使用多房棘球蚴囊液对22例健康志愿者全血中的单个核细胞及自然杀伤细胞进行刺激，发现细胞膜表面LAG-3、PD-1、CTLA-4的表达增加，说明多房棘球绦虫的免疫逃逸可涉及多个免疫检查点的调控，负向免疫调节是多房棘球绦虫持续感染的重要原因。目前尚未有根治HAE的特效药物，根治性手术仍是首选的治疗方案。根据专家共识[48]推荐，根治性切除或肝移植患者术后需至少服用2年以上的阿苯达唑预防复发。目前尚未有相关的预后数据对其预防复发的效果进行评价。据报道，部分患者即使术后规律服用药物预防，仍会出现复发的现象，目前机制尚未明确，还需进一步研究[51]。随着对棘球蚴病免疫逃逸认识的不断深入，免疫检查点疗法应用于术前降期及预防术后复发将成为下一阶段研究的热点。

3、小结

综上所述，LAG-3是一类表达于活化的淋巴细胞以及肿瘤浸润细胞表面的抑制性分子，参与效应T淋巴细胞、调节T淋巴细胞等细胞的增殖与活化，与HBV、HCV、HCC、ALD、NAFLD、HAE的免疫逃逸、免疫失衡密切相关。LAG-3常与PD-1/PD-L1共表达，单独或与其他检查点抑制剂协同应用有望克服药物低反应率及耐药性的问题，摆脱免疫抑制，提高机体免疫能力。但是，在LAG-3的研究中尚有不少问题亟待解决。首先，LAG-3负向调节T淋巴细胞功能的分子机制尚未明确，是否还存在其他潜在配体限制抑制剂发挥作用;其次，尚不清楚不同类型抑制剂发挥协同作用的分子机制，最佳的抑制剂组合尚未确定;再次，目前只有少量的LAG-3抑制剂进入临床试验尚未获得大规模的临床应用，缺乏足够的预后数据对其效果进行评价;最后，当前抑制剂价格普遍昂贵，能否通过优化抑制剂的分子结构降低生产成本从而减轻患者经济负担。总之，LAG-3有望成为下一代ICIs疗法的经典靶点，在调节机体淋巴细胞免疫反应、治疗肝脏相关疾病及评估患者预后方面发挥重要的作用。

陈锐,王志鑫,樊海宁,王海久.淋巴细胞活化基因3在肝脏相关疾病中的研究进展[J].临床肝胆病杂志,2021,37(04):977-981.