脑卒中属于急性脑血管疾病，具有高发病率、强致残性、高致死性、高复发率的特点。由世界卒中组织公布数据可知，到2020年为止，该病已成为全球第2大死亡原因与第3大残疾原因，显著增大了社会与家庭的负担[1]。脑卒中分为缺血性和出血性卒中，其中缺血性脑卒中占80%。目前静脉溶栓和机械取栓是美国食品药品监督局（FoodandDrugAdministration，FDA）获批的急性缺血性脑卒中（acuteischemicstroke，AIS）的一线治疗方式[2]，旨在早期恢复闭塞血管的血流灌注，拯救缺血半暗带，改善患者预后。然而，因时间窗狭窄，能进行溶栓与取栓疗法的患者占比只有8%～12%[3]。故而，寻求改善患者预后的新治疗方法迫在眉睫。

AIS的病理过程中，炎症反应的作用很显著[3]。AIS后，淋巴细胞、小胶质细胞、中性粒细胞与巨噬细胞等诸多免疫细胞被激活，并向缺血处迁移，使得炎症加重，对预后不利。在上述众免疫细胞中，中性粒细胞不仅占比最大，还首先侵入缺血处[3]。它们通过在血管内的滚动、粘附、爬行和跨膜迁移，最终浸润至脑实质。脑实质与外周的中性粒细胞会释放诸多不同细胞因子、趋化因子、蛋白酶与活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）等，引发炎症级联反应、兴奋性氨基酸毒性以及氧化应激，导致血脑屏障（blood-brainbarrier，BBB）破坏、脑水肿和神经功能受损[4]。相关临床研究结果表明，中性粒细胞量、中性粒细胞与淋巴细胞比值及系统免疫炎症指数（systemicimmune-inflammationindex，SII）增加与AIS预后不良显著相关[5-6]。动物实验对上述发现也给予了证实，耗竭中性粒细胞或抑制中性粒细胞的激活与浸润，能够使缺血再灌注损伤（ischemiareperfusioninjury，IRI）得到改善[7]。

然而，虽然AIS后中性粒细胞的免疫调节在临床前研究中显示出潜力，但它们尚未进入临床应用，可能是因为现有药物主要影响外周中性粒细胞的活性及数量，忽略了脑实质内中性粒细胞的死亡和清除。值得注意的是，中性粒细胞在外周循环中的半衰期较短，约为12h，而在组织中的半衰期则显著延长，是循环中的6～15倍[8]，这为中性粒细胞的功能多样性以及经历不同的死亡和清除过程提供了时间。现今已报道的中性粒细胞死亡方式有以下几类：NETosis、程序性坏死、凋亡、铁死亡与焦亡等[9]。小胶质细胞、巨噬细胞会将绝大部分已死亡中性粒细胞吞噬掉[10]。此外，中性粒细胞的表型转变，特别是抗炎性N2表型的中性粒细胞，更易于被巨噬细胞清除，这有助于缓解脑卒中后的炎症反应[11]。最新研究还发现，中性粒细胞可通过反向跨内皮迁移（reversetransendothelialmigration，rTEM）的方式，反向逃离炎症部位，有助于局部炎症消退[12]。本综述将讨论AIS后颅内中性粒细胞的多种死亡和清除方式及其对卒中预后的影响，揭示卒中后炎症反应的消退机制，分析如何通过促进中性粒细胞的死亡和清除来改善卒中预后，为寻找卒中后抗炎和免疫调节治疗提供新方向。

1、外周中性粒细胞的激活与浸润

中性粒细胞的生成起自骨髓与脾脏的造血干细胞（hematopoieticstemcells，HSCs）[13-14]，在调控方面，主要依赖下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）轴及交感神经系统（sympatheticnervoussystem，SNS）[13]。用小鼠构建短暂性大脑中动脉栓塞（transientmiddlecerebralarteryocclusion，tMCAO）模型，观察到骨髓中性粒细胞数量在卒中后10min至4h内急剧上升，12h后回落，粒细胞集落刺激因子（granulocytecolony-stimulatingfactor，G-CSF）、CXC趋化因子配体（CXCchemokineligand，CXCL）1有助于增殖的中性粒细胞向外周循环内快速释放[13]。脾脏的中性粒细胞数目在再灌注后12～24h达到高峰，2～7d逐渐恢复至正常水平。一些源于缺血脑组织的促炎因子，如白介素（interleukin，IL）-1β、肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）、IL-6等，会诱导HPA轴与SNS的活化，促使分泌皮质醇与去甲肾上腺素，由此对复杂的免疫反应施以调节，涉及迅速的免疫激活与之后的免疫抑制，表现为骨髓和脾脏中早期中性粒细胞增加及随后的脾脏萎缩[14-15]。此外，小胶质细胞、内皮细胞与星形胶质细胞这类缺血后颅内常驻细胞被激活，会释放众多趋化因子与促炎细胞因子在内的炎症信号，对脾脏与骨髓内中性粒细胞的激活与释放进行直接诱导[15]。最近的研究还发现，颅骨骨髓中的中性粒细胞可以通过颅骨骨髓与脑膜之间的微小通道直接迁移至相邻的脑实质[16-17]。由于骨髓和脾脏的快速动员，卒中后外周循环中性粒细胞计数迅速升高，12h最高，第4d开始下降[18]。G-CSF通过减少骨髓CXCL12的产生和中性粒细胞表面CXC趋化因子受体（CXCchemokinereceptor，CXCR）4的表达，刺激骨髓中成熟中性粒细胞释放至外周循环[8,19]。AIS后，外周中性粒细胞穿透BBB是浸润过程的关键环节。在血管内皮细胞表面粘附的中性粒细胞会经滚动、粘附及跨内皮等活动向脑实质处转移[20]，以小鼠构建永久性大脑中动脉栓塞（permanentmiddlecerebralarteryocclusion，pMCAO）模型，显示中性粒细胞在缺血6h后开始从软脑膜血管渗出，15h后迁移至梗死边缘皮质的血管周围间隙，24h后到达梗死核心区[20]，数量在1～3d达高峰，4～7d后逐渐下降[21]。AIS后，多种因素可促进中性粒细胞的激活和浸润。颅内活化的星形胶质细胞与小胶质细胞释放趋化因子，与中性粒细胞表面相应的受体结合，使其成为首个迁移至缺血脑组织的外周免疫细胞[21]。AIS后，死亡细胞会释放细胞因子、线粒体DNA、热休克蛋白、基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMPs）、ATP、高迁移率族蛋白1（highmobilitygroupbox1，HMGB1）以及趋化因子等损伤相关分子模式（damage-associatedmolecularpatternmolecules，DAMPs），伤及BBB，导致中性粒细胞向脑实质的浸润数量增多；而这些浸润的中性粒细胞释放促炎细胞因子、ROS、MMPs等，加剧BBB破坏，形成恶性循环[22]。

2、脑实质内中性粒细胞死亡和清除

AIS后，激活的中性粒细胞可浸润至脑实质，参与卒中后的炎性过程，加重缺血损伤。因此，促进颅内中性粒细胞的死亡和清除，是减轻AIS后炎症损害的重要步骤。中性粒细胞存在以下多样化的死亡途径：NETosis、程序性坏死、凋亡、铁死亡、焦亡等。死亡的中性粒细胞主要被颅内的吞噬细胞（小胶质细胞、巨噬细胞）清除[23]。此外，部分衰老的中性粒细胞会返回骨髓或肝脏，并在其生命周期结束时被巨噬细胞清除[19]。

2.1NETosis

在众死亡途径中，NETosis体现出一定特殊性[24]。此途径下，中性粒细胞具备活性，会释放中性粒细胞外捕获网（neutrophilextracellulartraps，NETs），其构成以双链DNA（double-strandedDNA，dsDNA）与组蛋白为主，周边附着大量HMGB1、中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophilelastase，NE）、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）等颗粒蛋白[24]。NETosis存在3种类型，其中自杀性NETosis（suicidalNETosis）最为经典，需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamideadeninedinucleotidephosphate，NADPH）氧化酶触发ROS的产生，并导致中性粒细胞死亡，通常在中性粒细胞激活后的数小时内发生；第二种是活力性NETosis（vitalNETosis），发生于中性粒细胞激活后的5～60min内，不需要NADPH氧化酶的参与，此时NETs的释放并不伴随细胞的死亡，中性粒细胞仍能保持其功能，如吞噬作用；最后一种是线粒体NETosis（mitochondrialDNANETosis，mtNETosis），常于中性粒细胞激活后的15min内发生，ROS作用于线粒体，引起mtDNA释放，形成NETs，未观察到中性粒细胞于此过程中发生死亡[24]。然而，NETs形成的机制仍然有争议，仍需进一步研究。

AIS患者外周血中NETs标志物水平明显升高，包括游离DNA（cell-freeDNA，cfDNA）、MPO、环瓜氨酸化组蛋白H3（citrullinateshistoneH3，CitH3）等，此类生物标志物水平和卒中的不良预后有紧密联系[25]。在pMCAO小鼠模型中，循环中性粒细胞快速经历NETosis，CitH3水平在卒中后12h达高峰，24～48h下降；外周血中的CitH3在6～12h后可通过软脑膜进入颅内，24h后出现在大脑皮质和纹状体，48h后下降[26]。在tMCAO小鼠模型中，脑实质内的NETs在tMCAO后6h出现，24h达高峰，48h后逐渐下降[27]。外周循环中的巨噬细胞和树突细胞具有清除NETs的能力，破坏DNA骨架、组蛋白和NE可以促进NETs的降解，然而我们对颅内NETs的清除仍知之甚少[28]。

NETosis过程受多种因素的调控，包括HMGB1、Toll样受体4（Tolllikereceptor4，TLR4）、ATP、ROS、肽基精氨酸脱氨酶4（peptidylargininedeiminase4，PAD4）与高血糖[29]。血小板源性HMGB1是脑卒中急性期NETs形成的关键诱导因子。特异性敲除HMGB1基因或耗竭血小板均能显著降低脑卒中后血浆中NETs水平，从而改善预后[30]。此外，血小板还能通过TLR4途径促进粘附血管内皮表面的中性粒细胞发生NETosis[31]。脑卒中急性期，神经元、小胶质细胞和星型胶质细胞释放ATP，激活中性粒细胞P2X7受体（P2X7Receptor，P2X7R），以P2X7R-Ca2+-PKC和ROS依赖的方式诱导NETs形成[32]。在小鼠tMCAO模型和AIS患者中观察到，缺血后神经元释放的冷诱导RNA结合蛋白（cold-inducibleRNA-bindingprotein，CIRP）可通过TLR4/p38途径促进NETosis[33]。由于ROS的产生对NETosis至关重要，NADPH氧化酶和MPO可诱导ROS的产生；而ROS抑制剂依达拉奉可通过抑制NETs生成，减轻缺血再灌注损伤及卒中后炎症[34]。PAD4抑制剂，如氯脒（Cl-amidine）、GSK484，也可抑制NETs生成，改善tMCAO模型小鼠预后[29,35]。越来越多的研究发现，高血糖状态会增加NETosis发生[36]。在pMCAO小鼠模型中，高血糖可加剧中性粒细胞浸润和NETs形成，而降低血糖可减小梗死体积，改善神经功能缺损[36]。可见，对于合并高血糖的脑卒中患者，二甲双胍可能具备潜在治疗价值。

AIS时，NETs会出现损伤BBB、导致组织型纤溶酶原激活剂（tissue-typeplasminogenactivator，tPA）溶栓抵抗、促进血栓形成、损伤血管新生和加重炎症反应等不利效应，导致卒中预后不佳[37]。NETs中的NE、MPO和组蛋白等成分参与BBB的破坏[35,38]，因此，清除NETs或抑制其生成，可减少紧密连接蛋白破坏，保护BBB完整性[35]。尽管尚不清楚tPA溶栓抵抗的确切机制，但已证实血栓中的NETs会导致溶栓抵抗。这可能是因为tPA无法降解NETs的DNA和组蛋白等成分；同时NETs的负电荷DNA主链能够吸附带正电荷的纤维蛋白，导致血栓内部的DNA和纤维蛋白缠绕[37]。在体外，NETs清除剂脱氧核糖核酸酶（Ideoxyribonuclease，DNaseI）可以加速tPA介导的血栓溶解，有助于血管再通，改善卒中预后，这提示DNaseI可能作为卒中后血管再通治疗的辅助药物[39]。NETs促进血栓形成的机制较复杂，首先NETs具有内皮细胞毒性；其DNA骨架还能为血小板、红细胞和促凝分子提供结构支持；此外，NETs中的DNA和颗粒蛋白还能激活血小板和内源性凝血途径[37]。在卒中晚期，NETs可影响梗死核心周围的血管新生，抑制NETs可显著增加新生血管形成和血流灌注，促进神经功能恢复[35]。

综上所述，抑制NETs生成或促进其清除，可能是治疗AIS的潜在靶点。秋水仙碱是FDA批准的首个针对心血管疾病的抗炎药物，它通过稳定细胞骨架和抑制巨噬细胞激活中性粒细胞，从而抑制急性冠脉综合征患者冠状动脉窦内中性粒细胞发生NETosis[40]。此外，全反式维甲酸作为一种抗炎药物，能减少tMCAO小鼠纹状体和皮质半暗带NETs形成，并促进颅内中性粒细胞被小胶质细胞/巨噬细胞清除，显著减少脑梗体积和改善神经功能[11]。tMCAO小鼠模型中，特异性抑制NE活性被证实可以减少NETs生成，减轻BBB破坏和神经炎症[41]。此外，一些具有MPO抑制作用的药物，例如葫芦巴碱和异鼠李素，在tMCAO小鼠或大鼠模型中，显示出能减少梗死体积，改善神经功能的作用[42-43]。虽然动物实验显示上述药物可获得积极疗效，但还需要通过更为深入的探究来明确其于临床领域的具体应用效果。

2.2中性粒细胞凋亡和胞葬

凋亡是中性粒细胞维持细胞稳态和促进炎症消退的一种非溶解性、抗炎性细胞死亡方式。在生理状态下，中性粒细胞主要通过非裂解途径进行凋亡。中性粒细胞凋亡后发挥抗炎作用的途径包括：激活T细胞途径；被DC细胞/巨噬细胞吞噬途径[9]。人类中性粒细胞的寿命相对较短，凋亡对于清除这些短寿细胞至关重要，而凋亡延迟或清除障碍可能导致细胞坏死，释放蛋白酶及促炎介质，进而引起组织损伤和慢性炎症[8-9]。AIS患者的外周循环中性粒的凋亡在卒中后48h内显著降低，7d后恢复正常[44]，这种变化可能反映炎症与中性粒细胞凋亡的负相关性，即凋亡的减少可能导致炎症的加重。在tMCAO小鼠模型中，使用多柔比星（doxorubicin，DOX）诱导中性粒细胞凋亡可以减少神经损伤，改善脑卒中预后[45]。另一项研究中，通过使用A151（一种端粒重复序列）抑制CitH3通路，将中性粒细胞NETosis重编程为凋亡，从而减少梗死面积和改善神经功能[46]。这些研究表明，促进中性粒细胞的凋亡可能有助于减轻炎症反应，改善AIS预后。

胞葬是清除凋亡中性粒细胞的重要机制[23]。最初，胞葬指清除凋亡细胞，但随后这一概念被扩展到包括其他类型的程序性死亡细胞。AIS后，吞噬细胞（如小胶质细胞与巨噬细胞）清除死亡细胞及碎片，抑制DAMP的释放和继发炎症反应[23]。胞葬缺陷会导致死亡细胞和碎片在局部积聚，不利于炎症消退，加剧脑损伤和不良预后[47]。在糖氧剥夺的海马切片培养模型中，发现颅内小胶质细胞不仅能吞噬凋亡的中性粒细胞，也能吞噬活的、非凋亡的中性粒细胞，从而保护神经元免受中性粒细胞的炎症损伤[48]。在tMCAO小鼠模型中，缺血半暗带区的小胶质细胞可吞噬清除中性粒细胞，小胶质细胞的缺失会导致颅内中性粒细胞数量增加，加重脑损伤[10]。

胞葬由凋亡细胞的识别、吞噬及消化这些基本过程构成[23]。首先，小胶质细胞/巨噬细胞P2Y12受体、TLR、CX3CR1和信号调节蛋白α（signal-regulatoryprotein-α，SIRPα）识别“找到我”（find-me）信号并向损伤区域趋化[49]。“吃我”（eat-me）信号，尤其是磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）外翻，是诱导小胶质细胞/巨噬细胞开始吞噬过程的关键信号[47]。与此同时，“别吃我”（don’teat-me）信号确保健康细胞不被错误清除。纤溶酶原激活剂抑制剂-1（plasminogenactivatorinhibitor-1，PAI-1）为一抗吞噬信号，处于中性粒细胞表面，其会降低巨噬细胞吞噬凋亡中性粒细胞的功能，由此使PAI-1受抑，促进中性粒细胞被吞噬，有助于消除炎症[50]。卒中后期，小胶质细胞/巨噬细胞吞噬中性粒细胞及其碎片有助于恢复脑解剖结构和生理功能[49]。在胞葬消化环节，被吞噬的中性粒细胞于小胶质细胞中成为吞噬体，同时融合溶酶体，成为吞噬溶酶体，有助于降解凋亡细胞内容物[49]。这一过程对于维持脑内环境的稳定和促进组织修复至关重要。

2.3中性粒细胞焦亡

细胞焦亡是一种由炎症小体引发的裂解性和促炎性的程序性细胞死亡，在缺血性损伤和炎症反应中扮演着重要角色[51]。中性粒细胞的焦亡由经典、非经典途径构成。两者分别对Caspase-1、Caspase-4/5/11具依赖性。前一途径，DAMPs联合病原体相关分子模式，将NLRP3炎症小体激活，从而促进Gasdermin-D（GSDMD）的裂解作用，使得IL-1β、Caspase-1、IL-18等促炎因子活化，发生细胞焦亡；另一途径中，在细菌脂多糖刺激下，Caspase-4/5/11裂解GSDMD，发生细胞焦亡。除外GSDMD，细胞焦亡也可由GSDMA/B/C/E诱导，并且在功能上差异不大[51]。

在AIS的早期阶段，GSDMD介导的细胞焦亡途径即可被激活。在tMCAO小鼠模型中，脑内GSDMD表达和剪切水平在卒中后开始升高，第3d达高峰，持续至第7d，中性粒细胞GSDMD信号可促进中性粒细胞骨髓动员和颅内浸润，GSDMD受抑，会使梗死体积缩小，同时使神经功能得到改善[52]。因此，靶向GSDMD已被证明可以减轻卒中后的脑损伤，改善神经功能缺损。GSDMD抑制剂，如双硫仑，能抑制中性粒细胞焦亡[53]。此外，GSDME也是调节中性粒细胞焦亡的关键分子。在GSDME缺失情况下，会有效阻止中性粒细胞的焦亡，转而经凋亡途径死亡，这种转变有助于巨噬细胞通过胞葬清除凋亡的中性粒细胞，有利于缓解炎症反应和促进组织修复[54]。

2.4铁死亡及程序性坏死

铁死亡是一种近年来新发现的程序性细胞死亡形式，自2012年Dixon提出以来，对其发生机制和治疗应用的研究取得快速进展[55]。铁死亡的特点为，对ROS具依赖性、铁与多不饱和脂肪酸链的磷脂的积累，涉及三个关键环节：氨基酸和脂质代谢、ROS的生成和铁的代谢调节[55]。在铁死亡过程中，铁引发的脂质过氧化受到抗氧化防御系统的调控，当铁代谢失衡，抗氧化系统不足以清除细胞内积累的ROS，细胞器和细胞膜会受到损伤。在SLE等和中性粒细胞炎症有关的自身免疫疾病中，自身抗体与干扰素-α通过激活钙/钙调蛋白激酶Ⅳ（calcium/calmodulinkinaseⅣ，CaMKⅣ），促进对转录具抑制效应的cAMP反应元件调节因子α（cAMPresponseelementmodulatorα，CREMα）结合在铁死亡中发挥关键性调控作用的谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathioneperoxidase4，GPX4）的启动子，以下调GPX4表达，随后细胞内脂质-ROS增加，氢过氧化物积累，抗氧化防御系统无法对其充分清除，导致中性粒细胞铁死亡[56]。尽管目前对于AIS后颅内中性粒细胞铁死亡的机制尚需进一步研究，但既往的发现为理解铁死亡在炎症中的作用和开发针对铁死亡的治疗方式提供了新视角。

细胞程序性坏死受遗传调控，会导致细胞溶解。在细胞无法通过正常的凋亡途径完成死亡程序时，会激活“替补”的程序性坏死。在调控程序性坏死方面发挥关键作用的是TNF-α、RIPK3、Caspase-8、混合系激酶结构域样蛋白（mixedlineagekinasedomain-like，MLKL）以及受体相互作用蛋白激酶1（receptorinteractingproteinkinase-1，RIPK1）等[9]。待死亡配体同死亡受体结合，会使RIPK1-RIPK3-MLKL通路活化，造成细胞程序性坏死。在与中性粒细胞相关的炎性疾病中，如皮肤血管炎、溃疡性结肠炎和银屑病，中性粒细胞迁移到炎症部位并激活RIPK3-MLKL通路，导致程序性坏死[57]。中性粒细胞程序性坏死在痛风的病理过程中起到重要作用，在痛风性关节炎小鼠模型中，使用RIPK1抑制剂necrostatin-1或沉默RIPK3基因，能减少中性粒细胞程序性坏死引起的痛风石形成[58]。尽管如此，但还需要更为深入地探究TNF-α、RIPK1-RIPK3-MLKL途径对于中性粒细胞程序性坏死的具体调控机制，以及两者和AIS之间的联系。

3、中性粒细胞反向跨内皮迁移（rTEM）

中性粒细胞不仅可以通过NETosis、凋亡、焦亡、铁死亡和程序性坏死等方式死亡，也可以通过rTEM离开炎症部位。中性粒细胞rTEM指细胞到达炎症部位后改变移动方向，反向穿过内皮重新进入血管内，这一过程与血管内皮细胞间连接黏附分子（junctionaladhesionmolecule-C，JAM-C）减少密切相关[59]。AIS患者外周循环中具有rTEM（CD54high/CXCR1low）能力的中性粒细胞增加，可能导致远隔器官损伤和多器官衰竭[12]。中性粒细胞的rTEM是一把双刃剑，一方面，rTEM的中性粒细胞通常表现为促炎表型，可以通过反向迁移减少受损组织内中性粒细胞数量，从而缓解局部炎症；另一方面，重新进入循环的中性粒细胞可能引起全身性炎症反应[60]。因此，准确调节中性粒细胞的rTEM可能成为治疗AIS的靶点。

4、小结

本综述聚焦于AIS后颅内中性粒细胞的死亡和清除机制，及其对卒中后炎症反应和预后的影响，这是当前脑卒中研究的热点。目前，已发现AIS后颅内中性粒细胞的死亡方式有NETosis、凋亡和焦亡，而铁死亡和程序性坏死等其他死亡方式仍需进一步验证。动物实验和临床研究均证实，通过促进中性粒细胞的凋亡、抑制NETosis或阻止焦亡能减轻卒中后的炎症反应，有望改善AIS预后。此外，我们不仅要关注中性粒细胞的死亡，还应关注其如何被清除，包括胞葬和小胶质/巨噬细胞的作用，这有助于揭示炎症反应的消退机制。综上所述，本综述深入分析了如何通过促进中性粒细胞的死亡和清除来改善卒中预后，为AIS的抗炎和免疫调节治疗提供了新的方向。

参考文献:

[4]江娜,许元,冯林玉,等.中性粒细胞在缺血性脑卒中的作用研究进展[J].神经损伤与功能重建,2023,18(11):651-655,666.

[6]马莉,吴凡,方传勤.全身免疫炎症指数与急性脑梗死患者静脉溶栓后早期神经功能恶化的危险因素分析[J].神经损伤与功能重建,2024,19(8):493-496.

基金资助:国家自然科学基金面上项目(小胶质细胞通过CIRBP诱导中性粒细胞NETosis在脑缺血再灌注后脑水肿中的作用和机制,No.82171306);

文章来源:肖青辉,李清灿,叶娇,等.急性脑卒中后颅内中性粒细胞的死亡和清除[J].神经损伤与功能重建,2025,20(07):414-419.