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研究应用培土清心方对特应性皮炎儿童肠道菌群的影响

2020-05-30 363 上传者：管理员

摘要：目的：通过高通量测序手段检测比较特应性皮炎(AD)患儿与健康对照儿童肠道菌群结构差异,并对比培土清心方干预前后对AD患儿的临床疗效及肠道菌群的改变情况,初步探索培土清心方对肠道菌群的影响。方法：共纳入60例受试者(实验组、健康对照组各30例),实验组分别在口服培土清心方0周(AD.0W)、4周(AD.4W)进行SCORAD评分并采集粪便样品,对照组在0周时采集粪便样品,统一对粪便样品进行16SrRNA基因测序检测。结果：实验组用药4周(AD.4W)SCORD评分降低,差异有统计学意义(P<0.05)。肠道菌群测序结果:①Alpha多样性:AD.0W组>AD.4W组>健康对照组(P>0.05)。②差异菌门水平:Firmicutes(厚壁菌门)相对丰度:AD.0W组<健康对照组<AD.4W组(P>0.05);Bacteroidetes(拟杆菌门)相对丰度:AD.4W组<健康对照组<AD.0W组(P>0.05);Faecalibacterium(柔嫩梭菌属)相对丰度:AD.0W组<AD.4W组<健康对照组,差异有统计学意义(P=0.00<0.05)。结论：特应性皮炎儿童和健康儿童肠道菌群多样性方面无差异,柔嫩梭菌属为健康人优势菌属;培土清心方可改善AD患儿病情,对肠道菌群多样性无明显影响,其可能通过上调厚壁菌门、柔嫩梭菌属,下调拟杆菌门丰度来达到减轻肠道炎症、改善AD的作用。

关键词：
16SrRNA基因测序检测
培土清心方
特应性皮炎
皮肤病
肠道菌群
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特应性皮炎(AD)是一种较常见的慢性、复发性、炎症性皮肤病。好发于婴儿和儿童,随着工业化的逐渐发展,该病的发病率逐年升高。流行病学调查显示,近30年来各国发病率均逐渐上升,影响着15%～30%的儿童和2%～10%的成人,给家庭、社会造成的经济负担也逐渐增加[1]。

“培土清心方”是广东省中医院陈达灿教授的自创方,专门针对辨证为心火脾虚的儿童特应性皮炎。该方在前期多年的临床实践中,获得了良好的临床疗效。中草药与肠道菌群的相关研究也提示,肠道菌群可能是中药在人体发挥药理作用的一个重要相关环节。基于上述认识,笔者采用16SrRNA基因测序技术,探讨培土清心方干预前后AD患者粪便微生物区系组成变化并与正常人进行比较,结果报告如下。

1、资料与方法

1.1一般资料

选取2018年1月-8月于广东省中医院皮肤科门诊就诊的特应性皮炎患者30例为实验组。纳入标准:①符合Williams诊断标准;②年龄2～12岁;③证型符合心火脾虚证;④同意服用中药并签署知情同意书(不满18周岁由其监护人签字)。排除标准:①不符合上述纳入标准者;②1个月内系统使用过糖皮质激素;③6个月内系统使用过益生菌、抗生素、免疫抑制剂或中药治疗。另选择同期来自本市体检中心的健康志愿者30例为健康对照组。对照组排便规律,无胃肠道疾病病史;本人及家属无过敏性疾病病史。两组研究对象在性别、年龄等方面差异无统计学意义(P=0.606,0.108>0.05)。

1.2治疗方法

实验组予培土清心法基本处方:太子参10～15g、淮山10g、薏苡仁9～15g、灯心草1～3g、淡竹叶6～10g、连翘6～10g、钩藤6～10g、生牡蛎15～30g(龙骨)、生甘草3g,水煎内服,1剂/d,连服4周。检测实验治疗前后肠道菌群数量及结构的变化。健康对照组仅在纳入研究时测定肠道菌群数量及结构的变化1次。

1.3样本采集

为入组的健康志愿者与AD患儿发放专用的OMNIgene·GUT(OMR-200)粪便样品采集管(该容器含有液体防腐剂“SAF固定液”,可稳定粪便中微生物DNA,能够在15℃～25℃条件下保存14d)。受试者在采集成功后将粪便样品带回/寄回医院,由专人负责标记姓名,并进行编号后存储于-80℃冰箱,干冰运送至上海泰昌基因科技有限公司进行检测。

1.4肠道菌群检测

1.4.1样品合格性检测

采样完成后,将90份粪便样品运输至检测公司实验室,抽提细菌总DNA,再检测DNA浓度和质量及进行PCR扩增,以确定是否符合试验要求。

1.4.2文库构建

采用标准的IlluminaMiseqPE300文库构建及测序流程,避免非官方barcode引起的扩增偏向性。

1.4.3IlluminaMiSeq测序及分析

应用IlluminaMiSeq测序平台对研究对象治疗前后粪便细菌的16SrRNA基因V3～V4区进行高通量测序及分析。

2、结果

2.1实验组培土清心方治疗前后SCORD评分比较

实验组培土清心方治疗4周(M=17.65)后较0周(M=26.45)SCORD评分下降,差异有统计学意义(P=0.001<0.05)。

2.2Alpha多样性比较

通过秩和检验显示,三组的Obserbedotus、Chao、Ace指数差异均无统计学意义(P>0.05);Shannon指数:AD.0W组>AD.4W组>健康对照组;Simpson指数:AD.0W组<AD.4W组<健康对照组,提示AD.0W组患者肠道菌群的Alpha多样性>AD.4W组>健康对照组,见表1,图1～2。

表1AD.0W组、AD.4W组与健康对照组Alpha多样性指数(x±s)

图1Simpson指数

图2Shannon指数

2.3AD.0W组、AD.4W组与健康对照组各菌门的相对丰度对比

占据绝对优势的两个主要菌门中,Firmicutes(厚壁菌门)相对丰度:AD.0W组<健康对照组<AD.4W组;Bacteroidetes(拟杆菌门)相对丰度:AD.4W组<健康对照组<AD.0W组,上述差异无统计学意义(P=0.30,0.07),见表2。

表2AD.0W组、AD.4W组与健康对照组主要菌门(占比≥1%)的相对丰度(x±s)

2.4AD.0W组、AD.4W组与健康对照组肠道菌群中的主要菌属的相对丰度

Faecalibacterium(柔嫩梭菌属)相对丰度:AD.0W组<AD.4W组<健康对照组,差异有统计学意义(P=0.00),Bacteroides(拟杆菌属)相对丰度:AD.0W组>健康对照组>AD.4W组,差异无统计学意义(P=0.32),见表3。

表3AD.0W组、AD.4W组与健康对照组各菌属的相对丰度 (x±s)

2.5差异菌群分析

肠道菌群中各物种的丰度方面,AD患者与健康对照组在细菌分类的门、纲、目、科、属多个水平上存在差异,本文详细比较最大分类水平门和最小分类水平属。

拟杆菌门在AD患者肠道菌群中的相对丰度高于健康对照,两组比较差异无统计学意义(P>0.05);厚壁菌门在AD患者肠道菌群中的相对丰度低于健康对照,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。在属水平上,柔嫩梭菌属在健康人中占优势,差异有统计学意义(P=0.00<0.05)。

厚壁菌门在培土清心方干预4周后相对丰度升高,两组比较差异无统计学意义(P>0.05);培土清心方干预4周后拟杆菌门相对丰度降低,差异有统计学意义(P<0.05);柔嫩梭菌属在培土清心方作用4周后,相对丰度明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。

3、讨论

特应性皮炎是多种复杂因素共同作用所致的、偏向Th2(IL-4优势的Th2)的炎症紊乱[2]。肠道黏膜免疫系统发育早期若未受到肠道微生物刺激,则会抑制机体免疫系统的自然发育,Treg细胞发育不成熟,无法调节Th1/Th2等若干平衡[9]。由此可见,由肠道菌群紊乱诱发的免疫失衡可直接影响特应性皮炎的发生、发展,并提出了“肠道-皮肤轴”的概念[3]。

本研究通过比较特应性皮炎儿童和健康儿童的肠道菌群,发现二者在菌群多样性方面无差异,这与韩国[4]一项研究结果相同。中药培土清心方干预4周后,患儿病情明显改善,肠道菌群多样性出现下降。这也从侧面反映出菌群多样性的上升对AD患者可能并非有益。

差异菌方面,相对丰度占绝对优势的菌门中,AD患儿肠道菌群厚壁菌门丰度较健康人低(P>0.05),且AD患儿进行培土清心方干预4周后,肠道厚壁菌门有逐渐升高趋势,尽管差异无统计学意义,但有数据表明,厚壁菌门菌群相对丰度低会增加肠道炎症的风险[5],推测厚壁菌门相对丰度的降低可能增加了肠道的炎症从而促使了AD的发病,并且培土清心方可以通过上调其丰度来达到减轻肠道炎症、改善AD的作用。但这需要后续增加样本量、疗程及观察时点来做进一步探索研究。

AD患者的拟杆菌门平均相对丰度较健康对照偏高(P>0.05),培土清心方干预4周后Bacteroidetes(拟杆菌门)相对丰度降低(P<0.05)。研究认为拟杆菌门具有一定的抗炎作用,该菌门的脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)表面的荚膜多糖A(PSA)激活了Toll样受体2(TLR2),促进了抑炎细胞因子IL-10的分泌,降低了IL-17等的水平[6]。拟杆菌门在用培土清心方干预后相对丰度下降明显,也许是与中药复方有抗炎作用有关,患者服用中药复方后炎症减轻,具有抗炎作用的拟杆菌门相对丰度随之降低。

在属水平上,柔嫩梭菌属在健康人中占优势(P=0.00),是人肠道中最常见的细菌,也是最主要的产丁酸盐细菌之一,而丁酸可为肠道提供能量并发挥抗炎作用[7]。且柔嫩梭菌属在培土清心方作用4周后,相对丰度明显升高,猜测柔嫩梭菌可能是有益菌,其自身相对丰度的增高,或者其产生的某种代谢产物增多,改善了肠道的免疫功能,减轻了患者的病情。

培土清心方由太子参、连翘等味中药组成,其功效为健脾渗湿、清心导赤,可抑制过高的Th2型细胞因子(IL-4、IL-10),抑制Th17细胞因子IL-17、1L-22水平,降低血清总IgE,促进Th1型细胞因子(IL-2、IFN-γ、sIL2R)的表达,改善Th1/Th2平衡失调,调节TNF-α[8];抑制炎症趋化因子和神经肽(MDC、CTACK、NGF、SP)[9],控制瘙痒,具有多靶点的免疫调节作用。从中医角度来讲,肠道菌群的平衡即是“正气”,失衡即是“邪气”,处于失衡状态则发病。培土清心方可能通过“培土”与“清心”两大类药物对AD患者的肠道菌群发挥了一定的扶正抑邪、纠正其菌群结构组成偏颇的作用。肠道菌群中厚壁菌门、拟杆菌门以及柔嫩梭菌属的丰度变化以及代谢产物可作为今后特应性皮炎发病机制研究的新的突破口,为临床上靶向调节肠道菌群治疗特应性皮炎提供科学依据。

参考文献：

[8]刘炽.清心培土法对特应性皮炎患者IL-2/TNF-α及其受体的影响和疗效评价[D].广州中医药大学,2009.

[9]廖勇梅,黎昌强,陈德宇,等.培土清心方治疗特应性皮炎的疗效观察及对血清NGF､SP影响的研究[J].辽宁中医杂志,2012,39(12):2344-2346.

裴悦,肖水明,莫秀梅,刘俊峰,梁家芬,张瑜,王楚阳,黄志海,李红毅.培土清心方对特应性皮炎儿童肠道菌群的影响[J].中国皮肤性病学杂志,2020,34(06):688-691.

基金:广东省中医院中医药科技技术研究专项(YN2016ML08);国家自然科学基金(81774307);广东省中医药局科研项目(20182042).