肺癌在全球范围内发病率和死亡率逐年上升,近几十年肺癌已经成为严重干扰健康的高发恶性肿瘤之一[1]｡ 许多因素造成目前肺癌的治疗复杂多变｡ 我国独具特色的中蒙药,作为恶性肿瘤治疗的辅助药物,和化学药物相比,有方便､便宜和反应小的优点,具有诱导肿瘤细胞凋亡､抑制肿瘤血管生长､调节肿瘤细胞信号传导等作用｡ 中蒙药抑制恶性肿瘤的作用原理已成为当今肿瘤研究的热点之一[2]｡细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种模式,它通过清除受损的细胞起到保护作用,从而起到维持体内平衡的作用[3]｡ 细胞凋亡途径的任何改变都可能导 致 包 括 癌 症 在 内 的 多 种 疾 病 的 发 生｡GADD45a基因是凋亡相关基因中很重要的一个,它能干扰细胞生长,能调节细胞周期监测点,参与DNA修复过程｡ 一些试验表明,GADD45a与细胞凋亡关系密切, GADD45a是第一个被确定的p53下游基因[4]｡ 近年来研究发现,因为GADD45a蛋白自身没有酶催化活性,所以GADD45a可以保持基因组的稳定,主要利用与其他蛋白之间的相互影响来实现,在信号传导､凋亡､DNA修复､细胞周期调控等多种细胞活动中起了非常重要的作用,是维持细胞基因组稳定性的重要成员[5]｡ 研究发现,GADD45a主要在核酸切除修复中起作用｡ 细胞DNA的损伤修复中,GADD45a利用直接与核心组蛋白相互联系,染色质的结构发生改变,使其它参与DNA修复的相关蛋白能参与进来,达到促进DNA修复目的[6]｡ 染色质与GADD45a能很容易结合在一起,这种相互联系可以促使损伤DNA部位与多种DNA损伤修复原件结合,加入到DNA损伤修复过程中[7]｡Caspase对不同细胞死亡的刺激反应而活化,引起大量细胞蛋白水解,最终导致这种死亡形式产生了生物学及形态学上的变化[8]｡Caspase - 3和Caspase - 7是哺乳动物细胞凋亡途径的执行者,它们在细胞凋亡的执行阶段及线粒体途径中发挥重要作用,如线粒体膜电位的去极化和促凋亡因子包括细胞色素C和凋亡诱导因子的释放[9]｡沙参四味汤包括北沙参､拳参､甘草､紫草茸｡目前一些临床研究证明沙参四味汤对肺癌的治疗产生了一定的影响[10]｡ 本实验研究沙参四味汤诱导人肺癌细胞凋亡及其对肺癌细胞GADD45a､Caspase- 3和Caspase - 7的影响,进一步探讨沙参四味汤抑制肺癌细胞生长的机制｡

1、材料与方法

1. 1实验试剂和仪器材料

沙参四味汤由内蒙古自治区人民医院中药房购买｡ 肺癌NCI - H460细胞:人大细胞肺癌细胞,贴壁生长,很难感染慢病毒,本实验所用NCI -H460细胞由北大肿瘤学院购买｡ 倒置相差显微镜(MOTIC AE - 21,美国);数码凝胶成像系统Odys⁃sey近红外荧光成像系统扫膜及计算机图像分析仪(MewImage软件,Gene公司,美国);冷冻高速离心机(Microfuge 22R,Beckman Coulter,美国);电热恒温鼓风干燥箱(DHG - 9070,上海恒一科学仪器有限公司,中国);超声波清洗机(KS - 500E1,宁波海曙科生超生设备有限公司,中国);显微图像采集分析系统(CX - 41,OLYMPAS,日本);GADD45a mon⁃oclonal antibody ( m01). clon3D12 (Abnova,美国);磷酸盐缓冲液PBS(福州迈新生物技术开发有限公司,中国)｡ 本研究经我院伦理委员会审核(编号:202404813L),符合医学伦理相关规定｡

1. 2实验方法及步骤

1. 2. 1免疫组化检测不同浓度

沙参四味汤处理后的肺癌NCI - H460细胞GADD45a的表达分别用10 μg / mL及20 μg / mL的沙参四味汤及对照组(生理盐水)处理肺癌NCI - H460细胞,置于37℃ ､5% CO2的培养箱中,孵育48 h｡ 用预冷的PBS洗涤细胞三次｡ 加入1 mL预冷的10%甲醛,室温作用10分钟｡ 室温下吹干,进行短暂预固定后储存于- 20℃冰箱｡ 室温放置30 min后,入4℃丙酮固定10 min｡PBS冲洗,5 min × 3次｡ 用3%过氧化氢孵育8 min,消除内源性过氧化物酶的活性｡PBS冲洗,5 min × 3次｡ 胃蛋白酶消化15 min去掉消化液滴加5%封闭液10分钟,不洗｡ 滴加试剂鼠抗人GADD45a抗体,4℃孵育过夜,PBS冲洗,5 min× 3次｡ 滴加试剂生物素的山羊抗鼠IgG,室温或37℃孵育20 ~ 30 min, PBS冲洗,5 min × 3次｡ 显色剂显色(DAB或AEC)｡ 自来水充分冲洗,复染,脱水透明,封片｡

1. 2. 2 FCM

检测沙参四味汤作用后肺癌NCI -H460细胞凋亡将处于对数生长期的NCI - H460细胞用0. 25%胰酶消化,接种于75 cm2的培养瓶内,每瓶加入1 ×104个/ mL的细胞悬液5 mL,置于37℃ ､5%的CO2培养箱内,待细胞生长进入对数生长期后,弃去旧培养液,分为三组,即对照组､10 μg / mL组和20 μg /mL沙参四味汤组,每组设3个重复,加入含药培养液5 mL /瓶,置于37℃ ､5% CO2培养箱内,培养48h后收集细胞,调整细胞浓度为1 × 106个/ mL,移入1. 5 mL的EP管中,1 000 r/ min离心5 min,弃上清,用预冷1 × PBS洗2次,每管加500 μL的BindingBuffer悬浮细胞;加入5 μL Annexin V - FITC混匀后,加入20 μL Propidium Iodide(PI),混匀;室温避光,反应15 min,进行FCM观察和检测细胞凋亡率｡

1. 2. 3荧光定量

PCR检测沙参四味汤作用后肺癌NCI - H460细胞Caspase - 3和Caspase - 7基因表达变化用20 μg / mL的沙参四味汤及对照组(生理盐水)处理肺癌NCI - H460细胞,置于37℃ ､5% CO2的培养箱中,孵育48 h,采用Trizol试剂提取总RNA,RNA反转录为cDNA,引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,以U6为内参,扩增目的基因Caspase - 3基因引物序列为5＇- TGTGGCATTGAGACAGAC - 3＇(上游)和5＇- CACTTGCCATACAAACTA - 3＇(下游),扩增片段长度为371 bp;Caspase - 7基因引物序列为5＇- TGACCTATCCTGCCCTCA - 3＇(上游)和5＇- TCTCCTGCCTCACTGTCC- 3＇(下游),扩增片段长度为107 bp;U6为内对照,引物序列为5＇- CTCGCTTCGGCAGCACA - 3＇(上游)和5＇- AACGCTTCACGAATTTGCGT - 3＇(下游)｡ 在10 μL反应体系中含有Mix 5 μL､上下游引物各0. 3 μL,cDNA 0. 5 μL､Rox 0. 02 μL､RNase -free water 2. 5 μL｡PCR反应条件为: Caspase - 3:94℃,3 min(94℃,40 s;48℃,1 min,72℃,1 min共40个循环)72℃,7 min｡Caspase - 7:94℃,3 min(94℃,40 s;53℃,1 min,72℃,1 min共40个循环)72℃,7 min,产物经实时荧光定量PCR上机检测显示样本cDNA扩增曲线､熔解曲线无杂峰,提示无非特异性产物扩增｡ 以U6基因做为内参基因,使用 比 较 法(△△CT)计 算 各 组Caspase - 3和Caspase - 7相对定量,并用(2-△△CT)来比较各组基因mRNA表达情况｡

1. 3统计学处理免疫组化结果

采用已采集的5个高倍镜视野图像用图像分析系统进行分析,求出平均灰度值｡ 平均灰度值越大,蛋白表达越低,SPSS 19. 0统计软件处理所有数据｡

2、结果

2. 1免疫组化检测

不同浓度沙参四味汤处理后的肺癌NCI - H460细胞GADD45a的表达沙参四味汤作用于NCI - H460细胞48 h后,免疫组化实验结果显示,对照组､10 μg / mL和20 μg /mL组均出现GADD45a蛋白呈颗粒状或团块儿状分布在细胞核内,呈棕黄色或棕褐色颗粒,与对照组比较,10 μg / mL和20 μg / mL沙参四味汤组着色较深(如图1),灰度值具有统计学差异(P < 0. 05,见表1和图2),此结果表明,沙参四味汤作用于人肺癌NCI - H460细胞后GADD45a蛋白表达显著升高｡

图1沙参四味汤对人肺癌NCI - H460细胞GADD45a蛋白的影响

表1沙参四味汤对人肺癌NCI - H460细胞GADD45a的影响

2. 2沙参四味汤对肺癌NCI - H460细胞凋亡的影响

沙参四味汤作用于NCI - H460细胞48 h后,利用FCM检测Annexin - V/ PI结果显示,对照组､10μg / mL和20 μg / mL组细胞凋亡率分别为0. 72%､1. 29%和1. 76% ,与对照组比较,10 μg / mL组细胞凋亡率增加(P < 0. 05);20 μg / mL组细胞凋亡率则显著增加(P < 0. 01)(如图3､表2)｡·34·赵瑞刚,等 沙参四味汤诱导人肺癌NCI - H460细胞凋亡的实验研究图2沙参四味汤作用48 h后人肺癌NCI - H460细胞GADD45a蛋白灰度值的表达变化Fig. 2 Effect of Shashensiwei decoction on lung cancer cellH460 of GADD45a gray value in 48 hours

表2沙参四味汤对肺癌NCI - H460细胞凋亡的影响

2. 3沙参四味汤对肺癌NCI - H460细胞Caspase-3和Caspase -7基因的影响

沙参四味汤作用于肺癌NCI - H460细胞后,提取细胞RNA,进行定量后反转录,产物经实时荧光定量PCR上机检测显示样本cDNA扩增曲线､熔解曲线无杂峰,提示无非特异性产物扩增｡ 以U6基因作为内参基因,使用比较法(△△CT)计算各组Caspase - 3和Caspase - 7相对定量,并用(2-△△CT)来比较各组基因mRNA表达情况｡ 结果显示,沙参四味汤作用后肺癌细胞Caspase - 3和Caspase - 7基因表达降低(P < 0. 05)(如图4､表3)｡

表3沙参四味汤对肺癌NCI - H460细胞Caspase - 3和Caspase - 7表达的影响

图3沙参四味汤对NCI - H460细胞凋亡的影响

3、讨论

肿瘤的药物治疗在临床上有着无法取代的地位,恶性肿瘤研究的重点之一是发现安全､高效的药物｡ 中蒙药在肿瘤的治疗中有着非常重要的作用[11 - 12]｡ 在近年的研究中,中蒙药含有治疗肿瘤的活性物质,可以抑制肿瘤发展,改善晚期患者的生存质量,提高患者的免疫力[13]｡GADD45a基因的 全称是生 长 阻 滞 与DNA损 伤 基 因( growth arrestand DNA damage GADD) ,GADD45a基因染色体全长3 278 bp,而mRNA的全长为1 355 bp,一共有4个外显子,蛋白半衰期一般为30小时,GADD45a在细胞核内表达最多,GADD45a在G1期表达水平最高,S期下降明显[14]｡ 一些试验表明,GADD45a与细胞的凋亡关系密切,在很多哺乳动 物细胞中,一些特殊的DNA损 伤 试 剂 可 以 诱导GADD45a基因表达[15]｡

图4沙参四味汤对NCI - H460细胞Caspase - 3和Caspase - 7基因的影响

细胞凋亡可通过半胱天冬酶(cysteiny asparatatespecific proteinases,Caspase)的蛋白酶家族介导的外源性或内源性途径触发[16];Caspases是细胞凋亡机制的 核 心,因 为 它 们 既 是 细 胞 死 亡 的 起 始 物(Caspase - 2､Caspase - 8､Caspase - 9和Caspase -10,主要负责凋亡途径的开始)和执行者(Caspase -3､Caspase - 6和Caspase - 7,负责细胞成分的明确分裂)｡Caspase在正常情况下以无活性的前体形式合成与贮存,一旦被激活,启动Caspases就会切断执行体Caspases,执行特定细胞底物的关键性分裂,最终导致细胞凋亡[17]｡Caspase - 3在细胞凋亡中起着不可替代的作用,Caspase - 3基因转染昆虫Sf9细胞后引起细胞凋亡,这个过程可以被Bcl - 2阻断;在发生凋亡的细胞提取液中去除Caspase - 3后,这些提取液就失去了诱导细胞凋亡的能力;再加入纯化的Caspase - 3它又能恢复致凋亡的功能｡Caspase - 3可以被多种因素活化,在CTL细胞的杀伤作用中,它既可被Fas/ FasL途径活化,也可以通过颗粒酶B途径活化[18]｡ 用Caspase - 7基因转染乳腺癌细胞系发现全长蛋白不能引起细胞凋亡,但去除氨基端53aa(其中包括原结构域)的Caspase -7则可以引起细胞凋亡[19]｡ 进一步研究证明去除原结构域的Caspase - 7具有自催化作用,可以自动催化成P10 / P12形式｡ 酶活性中心的半胱氨酸对Caspase - 7的这种作用十分重要,突变为Ala后就失去致凋亡作用｡ 当Fas和TNF引起的细胞凋亡时细胞内Caspase - 7也被活化, CrmA可以阻断Caspase - 7引起的细胞凋亡[20]｡ 研究表明,Caspase可调控细胞凋亡并在肺癌治疗中发挥重要作用[21],提高活化的Caspase - 3蛋白表达量可诱导肺癌细胞凋亡[22]｡ 在过去的几年中,关于肺癌细胞生物学行为的研究都集中在针对治疗药物敏感性的基因调控上[23]｡本研究中还采用了免疫组化技术对经沙参四味汤处理的人肺癌NCI - H460细胞培养48 h后来进行研究,免疫组化实验结果显示,对照组､10 μg / mL和20 μg / mL组均出现GADD45a蛋白呈颗粒状或团块儿状分布在细胞核内,呈棕黄色或棕褐色颗粒,与对照组比较,10 μg / mL和20 μg / mL沙参四味汤组灰度值具有统计学差异,此结果表明,沙参四味汤作用于人肺癌NCI - H460细胞后GADD45a蛋白表达显著升高｡FCM检测Annexin - V/ PI结果显示,与对照组比较,10 μg / mL和20 μg / mL沙参四味汤均可诱导肺癌NCI - H460细胞产生凋亡｡ 同时,荧光定量PCR检测到沙参四味汤作用后,肺癌NCI - H460细胞Caspase - 3和Caspase - 7基因表达降低｡综上分析,沙参四味汤对人肺癌NCI - H460细胞具有潜在的体外增殖抑制作用,沙参四味汤诱导肺癌细胞中GADD45a､Caspase - 3和Caspase - 7产生,促使人肺癌NCI - H460细胞凋亡,初步证实了沙参四味汤抗肿瘤的作用,从整体明确沙参四味汤的作用机制及为进一步研究打下一定基础｡

参考文献:

[4]赵瑞刚,韩秀花.蒙药沙参四味汤抑制人肺癌H460细胞生长作用的研究[ J].现代生物医学进展,2017,17(36):7736 - 7040.

[10]全喜,王秀兰.四味沙参汤研究进展[J].中国民族大学学报,2011,18(1):83 - 85.

基金资助:内蒙古自然科学基金(编号:2020MS08151);

文章来源:赵瑞刚,苏依拉其木格.沙参四味汤诱导人肺癌NCI-H460细胞凋亡的实验研究[J].现代肿瘤医学,2025,33(01):32-37.