胃癌前病变( PLGC)是指以胃黏膜萎缩为基础的肠化生和(或)异型增生〔1〕。胃癌是癌症死亡的第三大原因，其形成经历了慢性浅表性胃炎→萎缩性胃炎→肠化生→不典型增生→胃癌的过程〔2〕。伴有肠化生和/或不典型增生的萎缩性胃炎通常被称为PLGC〔3〕。因此，有效防治PLGC对降低胃癌发病率和死亡率具有重要意义。目前，西医治疗PLGC尚未形成统一、规范、有效的治疗方案，中药具有阻断或延缓恶性转化的作用，毒性低，副作用少〔4〕，在PLGC的治疗中容易被患者接受。因此，中药受到了越来越多的关注。人参皂苷 Ｒg3是从人参中提取的主要活性成分之一，具有广泛的药理活性，包括抗肿瘤、免疫调节、抗炎和抗氧化作用〔5，6〕。已有研究报道，人参皂甙 Ｒg3通过诱导细胞凋亡和抑制增殖发挥对PLGC大鼠的保护作用〔7〕，但具体机制尚不完全明确。相关研究显示，miＲ-1298-5p过表达可抑制胃癌细胞生长和侵袭〔8〕;抑制Toll样受体( TLＲ) 4可使大鼠胃黏膜损伤减轻〔9〕。生物信息学分析显示，miＲ-1298-5p与TLＲ4存在结合位点，而人参皂苷 Ｒg3能否通 过 调 控miＲ-1298-5p /TLＲ4轴对PLGC大鼠发挥保护作用尚不清楚。因此，本研究主要探究人参皂苷 Ｒg3对PLGC大鼠的影响及其作用机制。

1、材料与方法

1. 1细胞及动物HEK293细胞购自上海富雨生物科技有限公司。84只，6周龄，雄性SD大鼠购自广东南模生物公司(体质量190～200 g)，生产许可证号为SCXK(粤) 2022-0062。大鼠均在SPF级受控环境〔室温( 23±1)℃;湿度55%～60%〕中饲养，光/暗循环12 h，可自由进食和饮水。动物实验方案经医院动物伦理委员会的批准。

1. 2主要试剂

人参皂苷 Ｒg3(规格20 mg)购自上海晅科生物科技有限公司; N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍购自南通飞宇生物科技有限公司;维酶素购自上海研谨生物科技有限公司; miＲ-1298-5p拮抗剂( miＲ-1298-5p antagonist)购自美国MCE公司;北京康瑞纳生物科技有限公司的TUNEL细胞凋亡检测试剂盒;组织活性氧(ＲOS)检测试剂盒〔二氢乙啶( DHE)〕购自上海一研生物科技有限公司;兔源一抗TLＲ4、GAPDH、辣根过氧化物酶( HＲP)标记的山羊抗兔二抗均购自英国Abcam公司。

1. 3 PLGC模 型 大 鼠 构 建〔10〕

采 取 自 由 饮 用200μg /ml N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍联合隔日禁食的方法造模28 w构建PLGC大鼠模型，造模第8周若大鼠出现肠上皮化生，第12周出现异型增生，则为模型复制成功，继续造模直至28 w末结束。

1. 4实验分组

按照随机数字表法将84只大鼠随机分为对照组、PLGC组、人参皂苷 Ｒg3低、高剂量组、维酶素组、miＲ-1298-5p antagonist组、人参皂苷Ｒg3高剂量+miＲ-1298-5p antagonist组，每组12只。除对照组外，其余组大鼠均需按照1. 3所述方法构建PLGC大鼠模型，造模第17周时开始给药治疗，人参皂苷 Ｒg3低、高剂量组〔7〕、维酶素组〔11〕分别需灌胃1. 8、7. 2 mg /kg人参皂苷 Ｒg3、1 g /kg维酶素且均需尾静脉注射等体积的生理盐水; miＲ-1298-5pantagonist组〔12〕需尾静脉注射2 mg /kg miＲ-1298-5pantagonist且还需灌胃等量的生理盐水;人参皂苷Ｒg3高 剂 量+ miＲ-1298-5p antagonist组 需 灌 胃7. 2 mg /kg人 参 皂 苷 Ｒg3且 尾 静 脉 注 射2 mg /kgmiＲ-1298-5p antagonist;对照组、PLGC组需灌胃及尾静脉注射等量的生理盐水，给药1次/d，直至造模结束为止。

1. 5标本收集

末次处理结束后，腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉并处死大鼠，剖取出大鼠胃窦部组织，从胃窦部组织分离出胃黏膜组织，胃黏膜组织一部分用于实时荧光定量-聚合酶链反应( qＲT-PCＲ)、Western印 迹 实 验;另外一部分用于苏木素-伊 红( HE)染色、扫描电镜观察、TUNEL染色、DHE染色。

1. 6 qＲT-PCＲ 检测

胃黏膜组织中miＲ-1298-5p表达 使用TＲIzol试剂从胃黏膜组织中提取总 ＲNA，将总 ＲNA逆转录为cDNA后，以cDNA为模板进行定量PCＲ。以U6为内参，采用2－ΔΔCt法计算miＲ1298-5p相对表达量，引物序列为: miＲ-1298-5p:正向5'-ACACTCCAGCTGGGTTCATTCGGCTGTCCA-3';反向5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'; U6:正向5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3';反 向5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1. 7 Western印迹检测

胃黏膜组织中TLＲ4蛋白表达 将胃黏膜组织在含有蛋白酶抑制剂混合物的ＲIPA裂解缓冲液中裂解，然后将裂解物在4℃下以12 000 r/min离心10 min，使用二喹啉甲酸( BCA)试剂盒测定蛋白质浓度。将蛋白质经电泳、转膜、封闭后，将 膜 与 一 抗TLＲ4 ( 1∶2 000)、GAPDH ( 1∶1 000)在4℃ 下过夜孵育，然后与二抗在常温下孵育1 h，使用超增强化学发光试剂评估蛋白质表达。以GAPDH作为内参，使用ImageJ软件测定各条带的灰度值。

1. 8 HE染色检测大鼠胃黏膜组织病理损伤

用4%多聚甲醛固定胃黏膜组织，将每个样品包埋在石蜡中并连续切片至4μm的厚度。切片用HE染色，观察胃黏膜组织的病理学变化。

1. 9扫描电镜观察大鼠胃黏膜超微结构

将1 cm×1 cm×5 mm的胃黏膜组织用2. 5%戊二醛在4℃固定过夜，1%锇酸在室温下染色1. 5 h。使用一系列浓度的乙醇( 50%、75%、90%和100%)和叔丁醇( 50%、75%、90%和100%)进行组织脱水，每个组织切片用冷冻干燥机冷冻干燥，利用离子溅射仪喷金30 s。使用扫描电子显微镜观察胃黏膜组织的超微结构。

1. 10 TUNEL染色检测

大鼠胃黏膜上皮细胞凋亡从石蜡包埋的胃黏膜组织中切下4μm厚的切片，常规脱蜡和水化。将切片与蛋白酶K工作液在37℃下孵育20 min，然后与TUNEL反应混合物在37℃避光60 min，在荧光显微镜下观察TUNEL阳性细胞。细胞凋亡率=TUNEL阳性细胞数/总细胞数)×100%。

1. 11 DHE染色检测

各组胃黏膜组织中 ＲOS水平将胃黏膜组织冷冻切片升温至室温，同时控制湿度，然后干燥。将自发荧光猝灭剂 添加到切片中孵育5 min，自来水冲洗10 min。将DHE逐滴加入切片中，在37℃下孵育30 min。将切片置于磷酸盐缓冲液中( pH7. 4)，摇床振摇洗涤3次，5 min /次。将切片摇晃、干燥并用抗荧光淬灭密封剂密封。在荧光显微镜下观察切片，采集图像，红色荧光为阳性染周微红等 人参皂苷 Ｒg3通过miＲ-1298-5p靶向TLＲ4对胃癌前病变大鼠的保护机制使用ImageJ软件计算平均吸光度值。

1. 12双荧光素酶报告基因实验

分别构建TLＲ4突变 型 质 粒( TLＲ4-MUT)和 野 生 型 质 粒( TLＲ4-WT)，将TLＲ4-WT和TLＲ4-MUT分别与mimic NC或miＲ-1298-5p mimic共转染于HEK293细胞，48 h后观察荧光素酶活性变化。

1. 13统 计 学 分 析

采 用SPSS25. 0软 件 进 行SNK-q检验。

2、结 果

2. 1人参皂苷 Ｒg3对各组胃黏膜组织中miＲ-1298-5p、TLＲ4蛋白表达的影响

与对照组比较，PLGC组胃黏膜组织中miＲ-1298-5p表达显著降低，TLＲ4蛋白表达显著升高( P＜0. 05) ;与PLGC组比较，人参皂苷 Ｒg3低、高剂量组、维酶素组胃黏膜组织中miＲ-1298-5p表达显著升高，TLＲ4蛋白表达显著降低，miＲ-1298-5p antagonist组胃黏膜组织中miＲ1298-5p表达显著降低，TLＲ4蛋白表达显著升高( P＜0. 05) ;与人参皂苷 Ｒg3低剂量组比较，人参皂苷 Ｒg3高剂量组及维酶素组miＲ-1298-5p显著升高，TLＲ4显 著 降 低( P＜0. 05 )。与 人 参 皂 苷 Ｒg3高剂量组比较，人参皂苷 Ｒg3高剂量+miＲ-1298-5p antagonist组胃黏膜组织中miＲ-1298-5p表达显著降低，TLＲ4蛋白表达显著升高( P＜0. 05)，见图1、表1。

2. 2人参皂苷 Ｒg3对各组胃黏膜上皮细胞凋亡的影响

与对照组比较，PLGC组胃黏膜上皮细胞凋亡率显著降低( P＜0. 05) ;与PLGC组比较，人参皂苷 Ｒg3低、高剂量组、维酶素组胃黏膜上皮细胞凋亡率显著升高，miＲ-1298-5p antagonist组胃黏膜上皮细胞凋亡率显著下调( P＜0. 05) ;维酶组和人参皂苷 Ｒg3高剂量组凋亡率显著较人参皂苷 Ｒg3低剂量组上调( P＜0. 05)。人参皂苷 Ｒg3高剂量+miＲ1298-5p antagonist组凋亡率显著较人参皂苷 Ｒg3高剂量组下调( P＜0. 05)，见表1、图2。

2. 3各组胃黏膜组织中 ＲOS水平

与对照组比较，PLGC组胃黏膜组织中 ＲOS水平显著升高( P＜0. 05) ;与PLGC组比较，人参皂苷 Ｒg3低、高剂量组、维酶素组胃黏膜组织中 ＲOS水 平 升 高，miＲ1298-5p antagonist组大鼠胃黏膜组织中 ＲOS水平降低，差异显著( P＜0. 05) ;人参皂苷 Ｒg3高剂量组和维酶组 ＲOS水平显著高于人参皂苷 Ｒg3低剂量组( P＜0. 05)。与人参皂苷 Ｒg3高剂量组比较，人参皂苷 Ｒg3高剂量+miＲ-1298-5p antagonist组胃黏膜组织中 ＲOS水平显著降低( P＜0. 05)，见表1、图3。

2. 4人参皂苷 Ｒg3对各组胃黏膜组织病理损伤的影响

对照组胃黏膜完整，腺体排列规则。PLGC组胃黏膜萎缩变薄，腺体缩小，排列不规则，有大量炎性细胞浸 润 间 质。与PLGC组 比 较，人 参 皂 苷Ｒg3低、高剂量组、维酶素组胃黏膜组织病理损伤减轻，miＲ-1298-5p antagonist组胃黏膜组织病理损伤加重;与人参皂苷 Ｒg3高剂量组比较，人参皂苷 Ｒg3高剂量+miＲ-1298-5p antagonist组胃黏膜组织病理损伤严重，见图4。

2. 5人参皂苷 Ｒg3对各组胃黏膜超微结构的影响

对照组胃黏膜上皮细胞紧密相连，排列规则，结构完整。PLGC组胃黏膜上皮细胞萎缩，排列不规则，上皮细胞破裂脱落，导致局部胃黏膜损伤。与PLGC组比较，人参皂苷 Ｒg3低、高剂量组、维酶素组胃黏膜超微结构病变减轻，miＲ-1298-5p antagonist组胃黏膜超微结构病变加重;与人参皂苷 Ｒg3高剂量组比较，人参皂苷 Ｒg3高剂量+miＲ-1298-5p antagonist组胃黏膜超微结构病变严重，见图5。1～7:对照组、PLGC组、人参皂苷 Ｒg3低剂量组、人参皂苷 Ｒg3高剂量组、维酶素组、miＲ-1298-5p antagonist组、人参皂苷 Ｒg3高剂量+miＲ-1298-5p antagonist组;图2～5同

图1 Western印迹检测各组胃黏膜组织中TLＲ4蛋白表达

表1各组胃黏膜组织中miＲ-1298-5p、TLＲ4蛋白表达、ＲOS水平及上皮细胞凋亡率比较

图2 TUNEL染色检测各组胃黏膜上皮细胞凋亡(×400)

图3各组胃黏膜组织中 ＲOS水平( DHE染色，×200)

图4各组胃黏膜组织病理损伤( HE染色，×200)

图5扫描电镜观察各组胃黏膜超微结构病变(×400)

2. 6 miＲ-1298-5p靶向调控TLＲ4 targetscan网站预测

miＲ-1298-5p与TLＲ4的结合位点;见图6。与TLＲ4-WT和mimic NC共转染组比较，TLＲ4-WT和miＲ-1298-5p mimic共转染组的荧光素酶活性降低( P＜0. 05) ;与mimic NC和TLＲ4-MUT共转染组比较，miＲ-1298-5p mimic和TLＲ4-MUT共转染组荧光素酶活性变化差异无统计学意义( P＞0. 05)，见表2。

图6 targetscan网站预测miＲ-1298-5p与TLＲ4的结合位点

表2荧光素酶活性比较

3、讨 论

PLGC是胃癌的早期阶段，轻度至中度不典型增生的胃癌年发病率为0. 6%，重度不典型增生的胃癌年发病率为6%〔13〕。人参皂苷 Ｒg3是从中药材人参根中提取的最强效成分之一，具有显著的抗肿瘤和抗氧应激化作用〔14〕。据报道，人参皂苷 Ｒg3可抑制骨肉瘤的进展〔15〕;人参皂苷 Ｒg3可通过促进胃癌细胞凋亡来发挥对肿瘤的抑制作用〔16〕;人参皂苷Ｒg3可通过上调胃黏膜上皮细胞内 ＲOS浓度，进而诱导细胞凋亡，发挥对PLGC大鼠的保护作用〔7〕。本研究结果与其一致，提示人参皂苷 Ｒg3可减轻PLGC大鼠胃黏膜组织病理损伤及胃黏膜超微结构病变，促进胃黏膜上皮细胞凋亡，上调胃黏膜组织中ＲOS水平，且人参皂苷 Ｒg3剂量越高，对应的趋势越明显，表明人参皂苷 Ｒg3可能通过上调胃黏膜组织中 ＲOS水平促进胃黏膜上皮细胞凋亡，进而减轻PLGC大鼠胃黏膜组织病理损伤及胃黏膜超微结构病变，提示人参皂苷 Ｒg3可能成为治疗PLGC的潜在药物。证据 表 明，miＲNA参 与 了PLGC发 生 与 发展〔17〕。miＲ-1298-5p作 为 常 见 的miＲNA，已 有 研究显 示，miＲ-1298-5p水平下调可促进胃癌发展〔18〕。但关于miＲ-1298-5p在PLGC进展中的作用鲜有报道。本研究结果表明，miＲ-1298-5p确实与PLGC有关，人参皂苷 Ｒg3可促进PLGC大鼠胃黏膜组织中miＲ-1298-5p表达，且人参皂苷 Ｒg3剂量越高，对miＲ-1298-5p表达的促进作用越明显，推测人参皂苷 Ｒg3可能通过上调miＲ-1298-5p来发挥对PLGC大鼠的保护作用;人参皂苷 Ｒg3可能通过上调miＲ-1298-5p来发挥对PLGC大鼠的保护作用。miＲNA通过靶向抑制mＲNA的表达来调节生物学功 能。

生物信息学分析显示，TLＲ4为miＲ1298-5p的靶基因。据报道，TLＲ4在胃癌 中 高 表达，可以用作胃癌的生物标志物〔19〕; TLＲ4过表达促进大鼠PLGC〔20〕。本研究显示，TLＲ4蛋白在PLGC大鼠胃黏膜组织中高表达，人参皂苷 Ｒg3可促进PLGC大鼠胃黏膜组织中miＲ-1298-5p表达，且抑制TLＲ4蛋白表达，TLＲ4与miＲ-1298-5p存在靶向调控关系。证实了人参皂苷 Ｒg3可能通过上调miＲ1298-5p进而靶向抑制TLＲ4表达发挥对PLGC大鼠的保护作用。综上，人参皂苷 Ｒg3可能通过上调miＲ-1298-5p进而靶向抑制TLＲ4表达发挥对PLGC大鼠的保护作用。人参皂苷 Ｒg3对PLGC大鼠的保护作用可能还涉及其他通路，本研究尚未探讨，这是本研究的不足之处，后期将会进一步探索。

参考文献:

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10黎乐怡,卓俊城,谢凯枫,等.健脾化瘀解毒方调控PI3K/Akt /HIF-1α通路干预胃癌前病变大鼠胃黏膜上皮细胞自噬及凋亡〔J〕.中药新药与临床药理,2021; 32( 10) : 1444-51.

11李慧,刘金凤,奚玉杰,等.欣胃颗粒对胃癌前病变大鼠胃黏膜组织关键基因EGFR和PTEN表达的影响〔J〕.时珍国医国药,2022; 33( 7) : 1608-11.

基金资助:2022年全国名老中医药专家传承工作室建设项目(国中医药人教函[2022]75号);国家中医药管理局第七批全国中医药专家学术经验继承项目(国中医药办人教函[2021]272号);江西省教育厅科学技术研究重点项目(GJJ213302);

文章来源:周微红,洪建勋,傅斌,等.人参皂苷Rg3通过miR-1298-5p靶向TLR4对胃癌前病变大鼠的保护机制[J].中国老年学杂志,2025,45(03):656-661.