近年来，随着技术的发展，高分辨质谱的灵敏度与分辨率都得到了极大地提升。QTOF-MS作为一种先进的、多功能的高分辨质谱，不仅拥有完整的扫描功率，而且还拥有极强的灵敏度，以及准确的无损检测，使它能够准确地测定母离子与碎片离子的质量，以及它们的元素组成，从而使它在中药的化学成分分析领域得到广泛应用[1]。随着ESI(电喷雾电离技术)离子源的出现，飞行时间质谱仪取得了更快速的发展[2]。目前飞行时间质谱仪分辨率大多在1×104～5×104，可满足大部分中药小分子化合物的分析[1]。通过结合QTOF-MS、高效液相色谱技术和四极杆质谱技术，能够获得低丰度化学成分的二级质谱图，适合于中药复杂体系化学成分的检测与鉴定。据文献报道，高分辨液质联用系统已应用于多种复方中药制剂化学成分的鉴定分析研究中[3-4]。随着技术的不断发展，高分辨液质联用仪在中药制剂分析领域的应用将越来越成熟。

随着高校学科建设要求的不断提升，国内越来越多高校购置了高分辨质谱联用仪，这些仪器的添置为科研工作提供了强大的支持，但高校本科生接触该类仪器的机会却非常少，甚至有些学生在4年的本科学习中从未听过高分辨质谱仪，对仪器的工作原理、操作流程、应用范围等更是毫无概念，这显然与现代高等教育对学生的培养目标背道而驰[5-6]，因此，加强对本科生的培养，提升他们的技术能力格外紧迫。为了顺应双一流学科教育的发展，全面提高学校药学生的专业素养，暨南大学实验技术中心在针对本科生实验教学的大型仪器开放上进行了积极探索，编写实验内容、设计教学模式、进行实践磨课等，顺利开展了针对本校药学院中药制剂方向本科生的基于HPLC-QTOF-HRMS教学，经一段时间的试点教学，取得了良好的教学效果。本文将以通过高分辨质谱对中药制剂参松养心胶囊中5种特征性成分进行鉴定的实验教学为例，详细说明高分辨质谱在药学学科本科生综合实验教学中的应用。

1、实验教学方案

1.1 实验内容的选取

仪器分析的实验课教学中，实验内容的选取非常关键[7-8]，内容的设计不仅要着眼于学生专业知识和实验技能的培养，还要兼顾学生的兴趣，实验内容要能与学科前沿相关，能紧贴实际社会生产实践，能培养学生的科学思维能力和科研敏感性。本实验教学选取参松养心胶囊作为实验对象。参松养心胶囊是一种由12味中药组成的复方中药制剂，具有益气养阴，活血通络，清心安神的功效。在临床上常用于冠心病室性早搏属气阴两虚，心络瘀阻证[9-10]。目前《中国药典》(2020年版)关于参松养心胶囊的鉴别方法为对照品和对照药材的薄层鉴别法[11]。我们的学生在之前的专业课实验教学中已经熟练掌握使用薄层鉴别法鉴别中药制剂的方法。薄层鉴别法存在很多不足，比如手动操作比较多，人为因素影响大，实验人员的薄层技术的好坏直接影响实验的重现性等[12]。在本实验教学设计中，我们把高分辨质谱技术应用到中药制剂的鉴别分析中，首先使用高效液相色谱对参松养心胶囊提取液进行快速分离，然后使用高分辨质谱仪对主要成分进行定性分析和鉴定。该方法检测速度快，受人为因素影响小，实验重现性好。该实验的教学让同学们在掌握高分辨质谱技术的同时，充分了解仪器分析的优势，为未来的工作实践或者科研打开新的思路。

1.2 实验目的

(1)巩固和加强中药分析实验中样品前处理的操作技能。

(2)掌握HPLC-QTOF-HRMS的测定原理和操作方法。

(3)具备分析HPLC-QTOF-HRMS实验数据的能力，并能得到合理有效的结论。

(4)具备熟练查阅相关文献的能力。

(5)具备一定的中药制剂分析鉴别实验方案设计的能力。

1.3 实验原理

高分辨质谱可以给出样品的母离子和碎片离子的精确质量信息及可能的元素组成，在未知物的组成和结构鉴定方面的应用广泛。高分辨质谱的关键部件是质量分析器，根据质量分析器的不同，高分辨质谱可分为傅里叶变换静电场轨道阱质谱仪(FT-Orbitrap-MS)、飞行时间质谱仪(TOF-MS)和傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(FT-ICR-MS)[13]。其中，飞行时间质谱仪(TOF-MS)分析速度快，质量检测范围宽，离子传输率高，在中药领域应用广泛。飞行时间质量分析器根据时间的差异进行离子分离，其具体工作原理是离子源将分子电离产生离子，通过飞行时间池获得能量加速，质荷比大的离子，到达接收器的时间就会越长，反之，到达接收器的时间就越短，根据这一原理，不同质量的离子就可以按质荷比的大小进行分离，实现对物质的分析[14]。

在本次实验中，我们采用了QTOF-MS/MS质谱仪和电喷雾离子源(ESI)，其中ESI为一种软电离源，对分子结构破坏较少，可以产生[M+H]+或[M-H]-准分子离子峰，从而有效地确定待测物质的分子量，再根据其二级碎片和保留时间等信息，结合化合物的质谱裂解规律，即可实现对中药复杂成分的鉴定。

2、实验仪器、试剂及实验内容

2.1 实验仪器及试剂

高分辨液质联用仪：高分辨质谱为美国AB SCIEX公司生产的X500R QTOF型高分辨质谱仪，液相色谱系统为日本Shimadzu公司生产的LC-20AD型高效液相色谱仪。SHA-B型超声波清洗仪(上海比朗仪器)，New Classic MS十万分之一分析型天平(Mettler Toledo上海有限公司)，Titank C18液相色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm，美国Phenomenex公司)。

北京以岭药业有限公司生产的参松养心胶囊(批号B2301001)。甲醇和乙腈由美国Fisher公司生产(质谱级)，水为自制超纯水，其他实验试剂均为分析纯。

2.2 实验方法

2.2.1 色谱及质谱条件

色谱柱为Phenomenex Titank C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)；流动相乙腈(B)-0.1%甲酸水溶液(A)，梯度洗脱，洗脱程序见表1；体积流量设定为0.8 mL/min；进样量为5μL。

HPLC-QTOF-MS/MS型液质联用系统：离子源为ESI源，离子源温度为500℃，雾化气(gas1)压力为50 psi，干燥气(gas2)压力为60 psi，气帘气(curtain gas)压力为30 psi。正离子模式：喷雾电压为5500 kV，去簇电压(DP)为80 V，碰撞气(CAD gas)为7 psi；负离子模式：喷雾电压-4500 V，去簇电压(DP)为80 V。一级质谱采集范围为m/z 50～1000，累计时间150 ms；二级质谱采集范围为m/z 50～1000，累计时间40 ms，碰撞能量累加(CES):10 eV。

表1 梯度洗脱程序

2.2.2 供试品溶液的制备

取本品内容物约1.5 g，精密称定后，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入30 mL甲醇，超声20分钟，过滤，取续滤液经0.22μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.2.3 数据分析

查阅文献，对参松养心胶囊中药组成中药材的化学成分进行整理，选取有代表性的5种成分构建化学成分数据库，信息包括化学名称、分子式和碎片离子等。将数据库中化合物的化学名称和分子式导入Sciex OS软件的Analytics功能下的搜索列表，建立搜索方法。将采集到的高分辨质谱数据导入Sciex OS软件，在Analytics功能下提取质谱数据中潜在化合物色谱峰、一级质谱图和二级质谱图。

2.3 实验结果与讨论

2.3.1 参松养心胶囊化学成分分析

采用HPLC-QTOF-MS/MS高分辨质谱分别在正、负离子模式下采集参松养心胶囊的质谱数据，获得正负离子模式下样品的总离子流图，结果见图1。通过Analytics功能，查找包括丹参素、黄芩素、马钱苷、小檗碱和金丝桃苷这5类成分，并通过二级质谱确定其结构，分析结果见表2。

图1 参松养心胶囊总离子流图

表2 参松养心胶囊中的化学成分分析的鉴定结果

2.3.2 黄酮类化合物的确认

黄酮类化合物的基本母核为2-苯基色原酮，在自然界中广泛存在。黄酮类成分结构中常含有羟基，负离子模式下更容易电离形成稳定的氧负离子。文献报道，黄酮类化合物质谱裂解方式主要有-CO,-CO2,-H2O,-C2H2O以及RDA裂解、糖苷键断裂等。本实验在参松养心胶囊中鉴定两个特征性黄酮为金丝桃苷和山奈酚。金丝桃苷在供试品中的保留时间为27.28，一级质谱在负离子模式下出现准分子离子峰m/z 463.0878，推测分子式为C21H20O12。二级质谱中，碎片离子有m/z 301.0352推测为分子离子的糖链以异裂的方式脱去半乳糖而产生碎片离子[M-H-C6H10O5]-;m/z 300.0270推测为分子离子的糖链以均裂的方式脱去半乳糖而产生的碎片离子，m/z 271.0263推测是碎片离子m/z 300.0270进一步失去一分子CO和一个H而形成的碎片离子[M-2H-C6H11O5-CO]-,m/z 255.0297推测是m/z 301.0352进一步失去一分子CO和一个H2O而形成的碎片[M-H-C6H10O5-CO-H2O]-，参考文献[15-16]，推测其化合物为金丝桃苷，其质谱裂解途径见图2。

图2 推测金丝桃苷裂解途径

山奈酚在供试品中的保留时间为49.18 min，一级质谱显示其在负离子模式下出现m/z 285.0406的准分子离子峰，推测分子式为C15H10O6。经过二级质谱进一步裂解，出现m/z 257.04[M-H-CO]-碎片离子，推测为准分子离子峰失去一分子CO产生的碎片，而后再失去一分子CO，生成碎片离子m/z 229.05[M-H-2CO]-；碎片离子m/z 211.04[M-H-CO-HCOOH]-推测为m/z 257.04[M-H-CO]-失去一分子HCOOH形成。参考文献，推测其化合物为山奈酚[17]，化合物质谱裂解途径见图3。

图3 推测山奈酚裂解途径

2.3.3 生物碱类化合物小檗碱的确认

生物碱是一类含氮的碱性有机化合物，季铵碱类生物碱中氮原子带正电荷，在正离子模式下更容易电离产生稳定的信号。参松养心胶囊中的生物碱类成分主要来源于黄连药材。本课程鉴定了黄连中的特征性成分小檗碱，其在供试品中的保留时间为44.08，一级质谱在正离子模式下出现准分子离子峰为m/z 336.1219，推测分子式为C20H18NO4。在进一步的二级裂解过程中，准分子离子峰丢失一分子CH3后产生碎片离子m/z321.0981[M-CH3]+，而后进一步丢失一分子CHO，产生碎片离子m/z 292.0957[M-CH3-CHO]+。准分子离子峰通过失去一分子CH4，产生碎片离子m/z 320.0905[M-CH4]+；而后又通过失去一分子CH2，产生碎片离子m/z 306.0752[M-CH4-CH2]+，再进一步丢失一分子CO产生碎片离子m/z278.0803[M-CH4-CH2-CO]+，对照参考文献[18]，推测其化合物为小檗碱，并推测其可能裂解途径，见图4。

图4 推测小檗碱裂解途径

2.3.4 酚酸类化合物丹参素的确认

酚酸类化合物广泛存在于自然界中，是植物体内的一种重要的次生代谢产物，结构中含有羧基和酚羟基。在质谱中，其准分子离子峰常以[M-H]-形式存在。本课程从参松养心胶囊中鉴定了来源于丹参的酚酸类化合物丹参素。在供试品中，丹参素的保留时间为6.53，一级质谱显示在负离子模式下，出现m/z 197.0451的准分子离子峰，推测分子式为C9H10O5。二级质谱主要生成的碎片离子有m/z 179.03396[M-H-H2O]、m/z151.0404[M-H-HCOOH]、m/z 135.0448[M-H2O-CO2]、123.0448[M-H2O-2CO]，对照参考文献[19]，推测其化合物为丹参素，并推测其可能裂解途径，见图5。

图5 推测丹参素裂解途径

2.4.5 环烯醚萜类化合物马钱苷的确认

环烯醚萜类化合物在植物中的分布十分广泛，其主要分布于双子叶植物中，属于蚁臭二醛的缩醛衍生物。本课程从参松养心胶囊中鉴定了环烯醚萜类化合物马钱苷，其为山茱萸的主要药效成分。马钱苷保留时间为14.64 min，其在质谱正离子模式下，出现m/z 413.1411，推测为[M+Na]+形式的准分子离子峰，其分子式为C17H26O10。二级质谱裂解过程中，分子的糖苷键断裂，丢失一分子葡萄糖残基，生成碎片离子m/z251.0920[M+Na-C6H10O5]+，然后再进一步失去一分子CH4O，生成了碎片离子m/z 219.0631[M+Na-C6H10O5-CH4O]+，对照参考文献[20]，推测其为马钱苷，并推测化合物可能裂解途径，见图6。

图6 推测马钱苷裂解途径

3、结语

中药制剂分析是控制中药制剂质量、保证用药安全、合理、有效的重要手段。实验教学是中药制剂分析课程的重要环节。本次“利用高分辨质谱法对参松养心胶囊进行鉴别”的实验课共6个学时，该实验涵盖了多个技术训练，包含样品的前处理、液相色谱技术和质谱学原理、精确质量数计算、质谱结构解析、工作站的使用等，具有知识点多，综合性强，实用性强的特点。该实验课的开展受到学生的广泛好评，实验效果理想，对于培养现代化的本科药学人才具有重要的意义。

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基金资助:中国博士后基金项目(2021M701645);

文章来源:李雯,王林,李焕勇,等.基于高分辨质谱的中药学本科实验课程教学探索[J].广东化工,2024,51(18):195-197+224.